Loci SRNS  

Un locus di una malattia potrebbe essere identificato e localizzato mediante un'analisi dell'associazione dei geni localizzati sul medesimo cromosoma (la cosiddetta linkage analysis), basata sui seguenti principi.  
Se due loci, A (A1+A2) e B (B1+B2), sono su differenti cromosomi, si separeranno indipendentemente e c'è un 50% di possibilità che un figlio riceva l'allele B1 o B2.  
Se i loci sono sintenici, cioè se risiedono sullo stesso cromosoma, allora ci si potrebbe aspettare che segreghino insieme, senza ricombinanti.  
La possibilità che abbia luogo un crossing-over è direttamente dipendente dalla distanza dei due loci. Maggiore è la distanza, maggiore è la possibilità che si verifichi il crossing-over e, quindi, un evento ricombinatoriale.  
Le frazioni di ricombinazione sono una misura della distanza tra due loci e definiscono anche la distanza genetica.  
Per localizzare un locus di una malattia sono necessari marcatori genetici che dovrebbero essere sufficientemente polimorfi da dare una ragionevole possibilità che una persona scelta a caso sia eterozigote.  
Quando si utilizza un marcatore di DNA, le famiglie possono essere scelte per una linkage analysis perché hanno una malattia interessante oppure perché hanno una buona struttura per la localizzazione nella mappa genetica, con una ragionevole speranza che i membri della famiglia non siano tutti omozigoti (e quindi privi di informazione) per il marcatore.  
Gli strumenti standard per la linkage analysis sono ormai i microsatelliti, marcatori di DNA caratterizzati da ripetizioni di (CA)n. Sono numerosi e spaziati attraverso l'intero genoma umano.  
Usando questi marcatori di DNA, gli studi di linkage hanno mostrato la presenza di una notevole eterogeneità genetica per le SRNS, con 17 differenti loci finora identificati. In particolare gli studi di linkage hanno mostrato in due famiglie tunisine consanguinee, un LOD-score di 9,88 (q = 0,01) con il marcatore D13S175 localizzato sul braccio lungo del cromosoma 13.  
Al locus è stato assegnato il simbolo genico “DFNB1”.  
Ulteriori loci sono stati rapidamente localizzati. DFNB2 è sempre stato identificato in famiglie consanguinee tunisine sul cromosoma 11q13.54. DFNB3 sul 17p11.2-q12 in famiglie consanguinee di un remoto villaggio di Bali(5).  
Un quarto locus della sordità, DFNB4, riscontrato in popolazioni druse mediorientali, è stato localizzato sul 7q31(6).  
Tre loci addizionali, DFNB5, DFNB6, DFNB7, sono stati rispettivamente localizzati in 14q12, 3p14-p21 e 9q13-q21, studiando più famiglie consanguinee indiane(7,8,9).  
Il DFNB8 è stato localizzato nel braccio distale del cromosoma 21 in una famiglia pakistana con SRNS(10); il DFNB9, localizzato a 2p22-23, è stato identificato in una famiglia consanguinea che viveva in una regione isolata del Libano(11).  
Il DFNB10 è stato recentemente localizzato in una regione vicino al telomero del cromosoma 21 in una ampia famiglia consanguinea palestinese(12) e il DFNB12 sul 10q21-22 in una famiglia consanguinea di sunniti siriani(13).  
Infine, numerosi altri loci (DFNB11, DFNB13, DFNB14, DFNB15, DNFB16 e DNFB17) sono stati recentemente aggiunti al “Hearing Loss Homepage” sul Web. Una descrizione dei loci SRNS è riportata nella Tavola 1.  

Studi di associazione genetica: il ruolo dei DFNB1, DFNB2 e DFNB4 nei caucasici  

Oltre che nei pazienti tunisini, il DFNB1 si è dimostrato responsabile del SRNS in una famiglia beduina(14). Studi di associazione con i marcatori D13S175, D13S143 e D13S115 localizzati sul cromosoma 13 hanno dimostrato il ruolo importante di DFNB1 anche in famiglie neozelandesi e in una famiglia australiana(15). Questa scoperta suggerisce che il locus DFNB1 potrebbe dare un importante contributo alla sordità neurosensoriale autosomica recessiva nelle popolazioni caucasiche.  
Infine, si è mostrato che il DFNB1 è responsabile del danneggiamento uditivo in una numerosa famiglia di origine pakistana(16).  
Di recente abbiamo eseguito uno studio di associazione genetica con quattro marcatori microsatelliti associati al locus DFNB1 in 48 famiglie mediterranee (30 italiane e 18 spagnole)(17).  
Un LOD-score massimo di 7,28 secondo è stato trovato con il marcatore D13S115 a una frequenza di ricombinazione di 0.1. Valori significativi di LOD sono stati anche ottenuti per i marcatori D13S143, D13S292 e D13S175.  
La presenza di eterogeneità genetica è stata confermata usando il programma “HOMOG” che indicava l'assenza di legame al DFNB1 in approssimativamente il 20% del campione.  
Questi studi dimostrano chiaramente che il DFNB1 gioca un ruolo importante nell'80% delle famiglie mediterranee affette da SRNS.  
Inoltre i risultati di un'analisi più complessa hanno previsto la localizzazione del gene DFNB1 fra i marcatori D13S175 e D13S115, separati tra loro da circa 14.2 cM.  
In seguito, sono stati analizzati sei marcatori polimorfici, tre legati al DFNB2, sul cromosoma 11, e tre altri legati al DFNB4, sul cromosoma 7, nelle famiglie certamente non associate a DFNB1(18).  
Sono stati riscontrati valori di LOD-score positivi in 6 famiglie su 48 analizzate (,12) con marcatori del locus DFNB4. Il test di HOMOG ha mostrato presenza di eterogeneità genetica.  
Queste scoperte suggeriscono che un secondo locus (DFNB4) potrebbe giocare un ruolo importante nella nostra popolazione.  
Infine, due famiglie su 48 (,04) hanno mostrato la segregazione degli alleli dei marcatori associati al locus DFNB2.  
In questo caso il numero di famiglie probabilmente associate al DFNB2 è troppo basso per raggiungere una rilevanza statistica e per ottenere un valore di LOD-score positivo.  
Tuttavia la scoperta di due famiglie associate al locus DFNB2 ma non con gli altri loci SRNS finora studiati, è un buon suggerimento per una possibile implicazione del DFNB2 in una minoranza dei casi di sordità. Considerando che approssimativamente l'80% dei nostri pazienti sono stati associati al DFNB1 e che molto probabilmente una ulteriore percentuale di circa il 15% dei casi potrebbe essere associata al DFNB4 e al DFNB2, risulta che, nonostante la grande eterogeneità presente nella sordità recessiva, tre geni potrebbero influire contemporaneamente per almeno il 95% dei casi di SRNS nella nostra popolazione.  
Questa scoperta ha importanti implicazioni per la consulenza genetica e la prevenzione di questa comune malattia.  

Identificazione della connexina-26 (GJB2) come gene DFNB1  

Dopo la dimostrazione che una ampia percentuale dei casi di SRNS nella nostra popolazione di pazienti era legata all'DFNB1(17), la regione candidata a contenere il gene (~14,2 cM) è stata ulteriormente analizzata usando marcatori microsatellitari informativi addizionali per riuscire a restringere l'intervallo.  
Sono stati osservati numerosi eventi di ricombinazione che hanno ridotto ulteriormente la regione a circa 5 cM definita dai marcatori D13S141 e D13S232.  
Gli sforzi si sono allora concentrati nell'identificare i possibili geni candidati.  
Precedenti studi hanno dimostrato che l'espressione della connexina-26 avviene nelle cellule cocleari e i dati della mappatura genetica del genoma posizionano questo gene nell'intervallo definito dai nostri studi di associazione genetica.  
Le connexine dei mammiferi contengono la regione codificante in un singolo esone di circa 800 nucleotidi. Questo facilita notevolmente la ricerca di mutazioni.  
Una delezione di una base-singola (35 del G) localizzata 227 nucleotidi (nt) a valle del sito cap del mRNA, e 34 nt a valle del codone ATG della prima metionina è stata rilevata in 34 dei 54 cromosomi SRNS dei nostri pazienti italiani(19). Tre su sei pazienti spagnoli non imparentati e uno israeliano con SRNS legato al cromosoma 13, sono risultati omozigoti per la delezione G.  
Questa mutazione non è mai stata trovata nei cromosomi normali.  
La delezione risulta in una mutazione che porta alla formazione di una proteina tronca prematuramente. Un esempio di questa delezione segregante all'interno di una famiglia colpita da sordità è riportato nella Figura 1.  
Sono state trovate anche altre mutazioni che conducono sempre a una proteina GJB2 tronca e pertanto non funzionante (Gasparini, dati non pubblicati).  

Altri geni SRNS  

Nei pazienti affetti da SRNS sono state trovate mutazioni anche nel gene miosina VIIA (MYO7A), nel cromosoma umano 11q13 (DFNB2) (20,21).  
Il gene miosina VIIA si esprime nelle sterocilia delle cellule pilifere ed è l'ancora intracellulare per il contatto tra ogni sterocilium(22).  

La funzione della connexina-26 (GJB2)  

La connexina-26 è un componente di una grande famiglia di proteine coinvolte nella formazione delle giunzioni gap (gap-junctions) che permettono il trasferimento diretto di piccole molecole e ioni tra cellule adiacenti.  
Ogni cellula contribuisce per metà della giunzione gap, ed è composta da un insieme oligomerico di connessoni, che sono composti da un esamero di una proteina membranale integrale chiamata connexina (23,24).  
Un esempio schematico dei connessoni è riportato nella Figura 2.  
Le giunzioni gap sono rare tra i neuroni dei mammiferi, ma sono comuni nelle cellule non-neuronali, come la glia, le cellule epiteliali, le cellule lisce e le cellule del muscolo cardiaco.  
Ci sono più di 11 tipi differenti di connexine, ognuno con specificità tessutale e proprietà fisiologiche distinte in relazione alle giunzioni gap (24,25).  
Almeno altre due connexine sono implicate in malattie umane.  
Mutazioni puntiformi nel gene connexina-32 sono associate con la neuropatia Charcot-Marie-Tooth legata al cromosoma X(26), e mutazioni nel gene connexina-43 sono state trovate in pazienti con eterotassia e malformazioni cardiache.  
Il coinvolgimento delle giunzioni gap nelle risposte intercellulari al suono era stato proposto più di 20 anni fa(27,28).  
All'interno dell'organo auditivo, le  giunzioni gap sono localizzate tra le cellule pilifere esterne e le cellule di sostegno (inclusi i melanociti), fornendo una base morfologica per l'avvenimento delle risposte intracellulari al suono nelle cellule di sostegno e per l'accoppiamento elettrico delle cellule recettori.  
L'endotelio della scala media della coclea è coinvolto nella produzione di una risposta recettoriale allo stimolo uditorio ed è separato dallo spazio endolinfatico.  
Ultimamente l'analisi ultrastrutturale ed immuno-istochimica della connexina-26 nella coclea del ratto ha dimostrato che le giunzioni gap, sia nelle cellule epiteliali sia nelle cellule del tessuto connettivo, sono coinvolte nel riciclaggio degli ioni di potassio endolinfatici attraverso le cellule sensoriali durante la trasduzione del segnale elettrico in questi canali.  
L'identificazione delle mutazioni nel gene GJB2 conferma in modo chiaro il ruolo cruciale delle giunzioni gap nella trasduzione del segnale uditivo(19,29).  
La maggior parte delle mutazioni identificate nel gene GJB2 portano all'assenza completa della connexina-2619,29.  
Considerando che il GJB2 si esprime in diversi tessuti ma la sua perdita produce solamente la sordità, si deve assumere che altre connexine potrebbero sostituire la connexina-26.  
La connexina-26 e la connexina-32 possono formare eterodimeri con canali di giunzioni gap funzionanti (30,31).  
Tuttavia, le mutazioni nel gene connexina-32 determinano la neuropatia Charcot-Marie-Tooth(26), mentre le mutazioni nel gene connexina-26 causano sordità(19,29).  
Questi risultati suggeriscono che l'espressione della connexina-26 nella coclea sia indispensabile per l'udito e che le altre connexine non possano compensare la perdita della connexina-26 nelle cellule uditive.  

Prospettive  

Fino a pochi anni fa la sordità genetica era un mare magnum in cui l'assenza di conoscenza era la principale caratteristica.  
Successivamente sono stati descritti numerosi loci ed è stata chiaramente dimostrata la presenza di eterogeneità genetica, prima solo ipotizzata.  
In pochi anni il nostro lavoro ci ha permesso di dimostrare la presenza di un locus principale (cioè DFNB1) nelle forme trasmesse come carattere autosomico recessivo e poi di identificare il gene DFNB1 (GJB2), confermando il suo ruolo primario nel determinare le più comuni forme di sordità genetica.  
Inoltre l'identificazione di una mutazione molto comune nel gene GJB2 nella nostra popolazione facilita notevolmente la diagnosi molecolare e la consulenza genetica per la sordità congenita. L'identificazione di questa mutazione subito dopo la nascita dovrebbe aiutare a informare le famiglie e permettere, si spera, un trattamento più rapido dei bambini affetti.  

Paolo Gasparini, Paolo Fortina*, Xavier Estivill**, Salvatore Melchionda, Lucio Vigliaroli, Leopoldo Zelante  

Servizio di Genetica Medica e Divisione di ORL, IRCCS-Osp.CSS,  
S.Giovanni Rotondo (FG), Italy  
(*) Dept. of Pediatrics, Univ. of Pennsylvania, School of Medicine, The Children's Hospital  
of Philadelphia, PA, USA  
(**) Dept. of Molecular Genetics, IRO, Crta, Castelldefels Km 2,7, Hospitalet,  
Barcelona, Spain