ANALISI DEI TEST ANTICORPALI 
I test anticorpali esaminati saranno l’ELISA, il Western Blot, il test di cattura dell’antigene p24. 
                   
ELISA            (fig. 1) 

In Italia, per identificare l’infezione da HIV viene in prima istanza utilizzato un test di screening (ELISA), “dotato di buona sensibilità (vicino al 99%) e minore specificità, stimata attorno al 90-95% nel 1988”.  
Queste percentuali non debbono però trarre in inganno, infatti il valore predittivo del test varia a seconda della prevalenza dell’infezione in una determinata popolazione. Secondo un’ipotesi formulata dalla Commissione Nazionale AIDS nel 1988 , in caso di screening della popolazione carceraria italiana, di fronte a 6.902 veripositivi si sarebbero avuti 1.751 falsi positivi; invece, nel caso dei donatori di sangue, di fronte a 198 veri positivi, ben 99.990 sarebbero stati i falsi positivi (ben 505 volte di più!). 
Nel libro già citato “AIDS” , gli autori sostengono che i progressivi perfezionamenti del test hanno portato la sua sensibilità al 95% e la specificità al 99,8% in popolazioni ad alto rischio,valori che non si discostano di molto dai precedenti. Viene però ammesso che “il valore predittivo positivo può fluttuare grandemente in dipendenza della popolazione studiata”. In realtà così è avvenuto.  
Stando ad informazioni pubblicate sull’autorevole rivista medica inglese The Lancet, nel 1990, in Russia vennero fatti 20,2 milioni di test ELISA, di cui 20.000 risultarono positivi, ma solo 112 vennero confermati con il WB; nel 1991, su 30 milioni di test ELISA, ben 30.000 risultarono positivi, ma di questi solo 66 risultarono confermati dal Western Blot, cioè una percentuale minima (0,002%). 
“Dunque il test ELISA essendo stato disegnato per ottimizzare la sensibilità a spese della specificità, non dovrebbe essere usato da solo per la diagnosi di infezione da HIV-1 senza un test di conferma”, sebbene in alcune nazioni sia usato da solo. 

Il test Western Blot  (fig. 2) 

Il Western Blot (WB) viene comunemente usato come un test di conferma dell’infezione da HIV; la combinazione dell’ELISA e del WB vanta ufficialmente “un valore predittivo positivo maggiore del 99% per popolazioni a basso rischio e ad alto rischio”. 
Tuttavia neanche il WB appare così specifico come sostenuto se vengono analizzati alcuni dati a disposizione. 
a) Viene riconosciuto persino da fonti ufficiali che “è stato molto difficile  codificare la definizione su ciò che dovrebbe essere considerato un Western Blot positivo, a causa di discreti disaccordi”.  
Fino al 1993, negli Stati Uniti vi erano ben 5 criteri ufficiali, e solo uno (indicato nel kit diagnostico della Du Pont) era stato approvato dalla FDA (Food and Drug Administration). Questo era il più restrittivo ed era usato da pochi laboratori.  
Se fosse stato usato unicamente questo criterio, ben il 50% dei sieropositivi negli Stati Uniti sarebbero stati considerati come non infetti!  
In Italia, in una pubblicazione del Ministero della Sanità rivolta ai medici di famiglia , veniva negato che una questione del genere potesse costituire un problema. Al proposito si affermava: “nella grande maggioranza dei casi,indipendentemente dal criterio utilizzato, il test risulta correttamente classificato positivo quando l’individuo è infetto”. Il fatto che i risultati potevano essere ben diversi non veniva neppure menzionato. 
A tale situazione il rimedio è stato trovato semplicemente uniformando i diversi criteri senza riconsiderare il passato e senza chiarire i motivi scientifici per cui così si è optato. 
"I CDC hanno in un secondo tempo identificato i propri con quelli del ASTPHLD e nel 1993 la Croce Rossa statunitense si è adeguata adottando le raccomandazioni del ASTPHLD/CDC”. “Secondo l’ente americano ASTPHLD, un risultato positivo deve presentare almeno due delle tre bande maggiori di significato diagnostico (anti-gp41, anti-gp120/160, anti-p24)”.  
b) La lettura del WB è visiva ed è soggetta perciò ad interpretazione da parte dell’operatore, un fattore di variabilità non trascurabile. “La sua tecnica (ndr: del Western Blot) non è stata standardizzata, l’importanza e le conseguenze delle variazioni verificatesi nei laboratori non sono ancora state misurate. I suoi risultati richiedono d’essere interpretati; i criteri per queste interpretazioni variano non solo da laboratorio a laboratorio, ma anche di mese in mese”. 
Il Consorzio statunitense per la Standardizzazione della Sierologia Retrovirale (CRSS) ha effettuato un controllo di qualità inviando 19 quote dello stesso siero a 19 laboratori di riferimento ed il confronto dei risultati ha dimostrato una strabiliante differenza del numero di bande e della loro intensità nelle diverse “striscie” (fig. 3). 
Le preparazioni antigeniche non sono purificate. 
“La presenza di bande in posizioni non corrispondenti a noti antigeni virali è un ritrovamento piuttosto comune e si presume sia la conse               guenza di contaminanti nella preparazione ...”. “Il peso molecolare di queste bande aberranti può variare da ditta a ditta  o persino da lotto a lotto della medesima ditta produttrice”. 
Ecco il commento di Zolla-Pazner nel 1989: “Confusione sulla identi               ficazione di queste bande (n.d.r.: i risultati del test Western Blot)            è risultata in conclusioni scorrette negli studi sperimentali. [...] potrebbe essere necessaria la reinterpretazione dei risultati già pubblicati”.  
Questa auspicata reinterpretazione non è avvenuta fino al momento attuale (marzo 1998). 
d) Bande considerate “specifiche” non indicano in molti casi un’infezione da HIV. Seguono alcuni esempi. 
- Pur utilizzando i criteri più restrittivi, Lundberg osservò che ben il 10% dei sieri di controllo, che includevano campioni di sangue dalle banche del sangue, avevano un WB positivo. 

- In uno studio, si rilevava che dal 2 al 49% dei pazienti testati potevano avere una reattività al WB (WB indeterminato), più frequentemente causata da anticorpi cross-reagenti. 
- Anche una semplice vaccinazione anti-influenzale può rendere positivo il risultato. 
- Anche la trasfusione del proprio sangue irradiato produce gli stessi anticorpi. 
- Tra gli omosessuali o bisessuali che risultano negativi per l’ELISA e la PCR, 20%-30% possono avere una o più bande presenti sul Western Blot. 
- Dati ancora più sconcertanti riguardano uno studio effettuato su dei cani e pubblicato nel 1990. Scrivendo su Cancer Research, Strandstrom e colleghi riportarono che 72 su 144 (50%) campioni di sangue canino ottenuti dall' Ospedale Veterinario dell’Università di California, e testati con il Western Blot reagivano con una o più proteine ricombinanti dell’HIV [gp120--21.5%, gp41--23%, p31--22%, p24--43%]“.  
Poiché gli Autori considerano i cani non infetti con l’HIV, si deve concludere che questi dati sono una ulteriore prova della frequente cross reattività anticorpale con molte “proteine diverse da quelle dell’HIV”.  
E' importante, a questo punto, introdurre alcune considerazioni. 
Il fatto che le bande siano definite non specifiche se ritrovate singolarmente, ma specifiche per il virus se presenti in numero di due o più di due, appare rifarsi non a considerazioni di ordine biologico, ma ad una convenzione, ad un accordo di tipo “legale”, variabile nel tempo e nello spazio (infatti è differente nelle diverse nazioni).  
Secondo una convenzione che era accettata fino a non molto tempo fa da molti autori, tre bande nel WB di un donatore di sangue clinicamente sano erano considerate false reazioni positive.  
Secondo la medesima convenzione, le tre bande dello stesso donatore di sangue, questa volta presentate ad una Società di Assicurazione per una polizza sulla vita, sarebbero state considerate vere  positive!  
Il gruppo di ricercatori di Perth che ha analizzato a fondo il significato del  WB, ha concluso che le proteine considerate virali non sono peculiari del virus HIV e sono indistinguibili da proteine di origine cellulare.  
In particolare, secondo lo studio finora non confutato della Eleopulos e coll. , la gp 41 corrisponderebbe all’actina;  la p18 e la p24/25 alle due subunità della miosina (la p24 è la banda aspecifica ritrovata con maggior frequenza in soggetti “non infetti”); la p32 sarebbe identica alla catena beta dell’antigene DR della classe di istocompatibilità II; la gp120-160 non sarebbero nient’altro che oligomeri della gp41. 

Antigene p24 

La valutazione del test di cattura dell’antigene p24 è stato compreso in USA tra i test che vengono effettuati ad ogni unità di sangue (e considerato come “diretta evidenza del virus HIV”). 
Secondo Fauci e coll.  , viene ritenuto che: 
a) la p24 corrisponde all’antigene del capside virale (core) che viene evidenziato da un siero contenente i relativi anticorpi monoclonali (anti-p24) associati ad un sistema rivelatore; 
b) il test comunque non è utile come mezzo di screening primario nello stabilire una diagnosi precoce di infezione da HIV; 
c) l’aumentare del livello della p24 presumibilmente correla con l’esplosione nella replicazione virale, rilevabili con altri metodi come la viremia plasmatica; 
d) il livello di p24 usualmente cade sotto la soglia di determinazione con metodi convenzionali come l’anticorpo anti-p24, comincia a formarsi durante la sieroconversione e può rimanere in quello stato durante i seguenti anni di infezione asintomatica. Solamente il 20-30% di individui con infezione asintomatica ha livelli rilevabili di p24 sierico. 
Tuttavia le perplessità sul suo reale significato sono molteplici.  
Dati quantitativi indicano che in pazienti sieropositivi possono essere ritrovati 50 pg e talvolta più di proteina del core, la p24.  
Se un retrovirus pesa 10 -3pg e metà del suo peso è costituita da p24   15, questa quantità corrisponde allora a circa 100.000                               particelle virali; secondo altri autori e secondo altre premesse addirittura a 500.000 particelle!  
Dunque, se tutta questa proteina venisse dai virioni, questi pazienti dovrebbero essere altamente viremici.  
In altre parole vi dovrebbe essere una corrispondenza diretta tra livelli di p24, “isolamento virale”, livelli di “RNA virale” (detta anche “carica virale”). Invece così non è. I risultati sono irrimediabilmente differenti da quelli che logicamente sarebbero attesi.  
Per esempio, un lavoro riporta la presenza di antigenemia ma che nessun virus poté essere isolato da 31 pazienti antigenemici, anche in seguito a coltivazione estesa. 
Osservazioni analoghe sono riportate da altri studi.  
Ne vengono citati alcuni:  
1) "in metà dei casi in cui una persona aveva un test positivo, sus               seguentemente ne aveva uno negativo senza assumere alcuna medicazione che avesse potuto alterare i livelli di p24... il test è clinicamente erratico e dovrebbe essere interpretato molto cautamente”.  
2) l’antigene p24 non è ritrovato in tutti i soggetti sieropositivi e neppure quelli con AIDS conclamato. In uno studio, la PCR (Polymerase Chain Reaction) e la p24 furono usati per scoprire l’HIV in pazienti in vari stadi, da asintomatici ad AIDS. La p24 fu trovata nel 24% dei pazienti e l’HIV-RNA nel 50%. 
3) Oltre il 29% dei riceventi una trasfusione da soggetti sieronegativi, diventa positiva per l’anticorpo anti-p24, pur “in assenza di infezione”. 
4) La non specificità del test dell’antigene p24 è così ovvia che è accettata da un’autorità riconosciuta nel campo, Philip Mortimer -e i suoi colleghi- del Public Health Laboratory Service in Inghilterra: “L’esperienza ha dimostrato che né la coltura virale, né i test per la p24 sono di gran valore nel test diagnostico. Essi possono essere non sensibili o non specifici”. 

Conclusione 
           
I test anticorpali (l’ELISA, il Western Blot ed il test di cattura dell’antigene p24) per i numerosi motivi sopra esposti, non sono in grado di segnalare con ragionevole sicurezza di trovarsi di fronte ad un’infezione con il virus HIV e perciò l’asserzione che il valore predittivo positivo del WB possa essere considerato superiore al 99% non corrisponde alla realtà.  
Questi test rivelano reazioni di una specificità variabile o meglio indeterminata, tanto da non poter permettere una distinzione tra cross reattività e “infezione da HIV”.  

L'IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEL VIRUS 
            
E’ comune convinzione che i test anticorpali siano stati convalidati e in qualche modo verificati da altri in grado di evidenziare il virus stesso, test capaci di identificarlo direttamente.  
Tuttavia, questa determinazione diretta è tale solo all’apparenza. Si limita a registrare alcuni fenomeni che si crede siano legati in maniera inequivocabile all’HIV. 
L’identificazione diretta del virus è divisa in due principali categorie  :  la coltura virale e l’identificazione diretta degli acidi nucleici virali (Southern Blot, tecniche di amplificazione come PCR, RT PCR, bDNA, NASBA). 

La coltura virale 

L’isolamento virale usualmente coinvolge una co-coltura delle cellule del paziente con cellule di un donatore non infettate che sono state stimolate con fitoemoagglutinina (PHA) per 3 giorni.  
Queste co-colture sono controllate approssimativamente ogni 3 giorni per 28 giorni o più per controllare la formazione di sincizi e la presenza di p24 o la transcriptasi inversa (RT) nel sopranatante della coltura.  
La presenza di sincizi (a) o dell’antigene p24 (b) o della RT (c) è considerata evidenza di replicazione virale. 
Secondo Gallo ed altri autori anche il ritrovamento di particelle simil-virali in coltura è da ritenersi criterio sufficiente. 

a) Comparsa di sincizi 
La comparsa di sincizi è osservata solamente in una parte delle colture considerate infette, ma le stesse sono presenti anche in linee cellulari “non infette” e simili a quelle utilizzate per l’HIV.  
Così tali caratteristiche morfologiche cellulari potrebbero essere una caratteristica delle stesse linee cellulari, del risultato delle condizioni di coltura o di entrambi questi fattori. 

b) Antigene p24 
La sua mancanza di specificità è già stata menzionata. Le obiezioni al suo utilizzo come test sul siero del paziente sono valide anche per il suo utilizzo nelle colture. 
In uno studio in cui è stato utilizzato questo metodo di “isolamento virale” (la determinazione della p24 in colture con sangue intero non frazionato), risultati positivi sono stati ottenuti in 49 su 60 “individui” (82%) presumibilmente non infetti ma sierologicamente indeterminati e in 5 su 5 donatori di sangue sieronegativi. 

c) Transcriptasi inversa (RT) 
In tutta la ricerca sull’HIV, è considerata quale prova di attività transcriptasica inversa dell’HIV la capacità di copiare lo stampo-innesco (template-primer) A(n).dT<->15 quando incubato con il sopranatante o il materiale proveniente da co-colture di materiale infetto con il virus dell’AIDS che si separa ad un livello di 1,16 gm/ml (gradiente di densità in sucrosio). 
In molti casi questa attività è considerata sinonimo di “isolamento dell’HIV”. 
Comunque: (i) Lo stesso stampo-innesco è anche copiato quando incubato con materiale che si separa nella banda 1,16 mg/ml da colture di cellule leucemiche e spermatozoi non infetti; ii) lo stampo-innesco A(n).dT<->15 può essere trascritto non solo dall’RT, ma anche da altre polimerasi cellulari del DNA. Tutte le polimerasi cellulari del DNA, alfa, beta e gamma possono copiare l’A(n).dT. Infatti, nel 1975, una Conferenza Internazionale sulle polimerasi eucariotiche del DNA che comprendeva Baltimore e Gallo, definì la polimerasi gamma del DNA, “un componente delle cellule normali”, la cui attività può essere aumentata da molti fattori compresa la stimolazione del PHA, l’enzima che “copia l’A(n).dT<->15 
con alto rendimento, ma non copia bene il DNA”; 
Da quanto sopra si deduce che è errato affermare che tale attività enzimatica sia peculiare dei retrovirus, tanto meno che sia indice inequivocabile della presenza del retrovirus HIV. 
Le particelle e le proteine che si separano a livello della banda 1,16 mg/ml potrebbero riflettere materiale interamente non virale; sicuramente gran parte dello stesso materiale è cellulare e proveniente da colture stimolate con PHA (come vedremo meglio in seguito), per cui l’attività transcriptasica potrebbe derivare da esso. 
  
Oggetti con l’aspetto retrovirale 
Il ritrovamento di particelle simil-retrovirali in coltura fu considerato da Gallo prova di isolamento dell’HIV (allora HTLV-III). Tuttavia Gallo, per isolare l’HTLV-IIIB, usò la linea cellulare H9 (HUT78) e tale linea cellulare rilascia particelle simil-retrovirali anche quando “non infetta con l’HIV”. 
Weiss ha ottenuto il suo “isolato CBL-I” dalla linea cellulare leucemica CEM, una linea cellulare che ospitava retrovirus anche quando non infettati con l’“HIV”. 
Nel 1970, tali particelle erano frequentemente osservate nei tessuti leucemici, in colture di tessuti embrionali e nella maggioranza se non in tutte le placente umane. 
Particelle di tipo C mature od estroflesse appaiono in cellule linfomatose metabolicamente danneggiate ma non infette con l’HIV.  
“Particelle retrovirali” antigenicamente simili all’HIV sono state trovate in estratti da colture di ghiandole salivari di pazienti con la sindrome di Sjorgen.  
Più importante ancora, nell’unico studio di microscopia elettronica, sia in vivo che in vitro in cui furono usati adeguati controlli ed in cui fosse stato effettuato un estensivo esame in cieco dei controlli e del materiale del test, vennero trovate “particelle virali indistinguibili dall’HIV” in una varietà di linfoadenopatie reattive non associate all’HIV, portando gli autori a concludere: “La presenza di tali particelle non indicano, di per sé stesse, un’infezione con l’HIV” (fig. 4). 

Conclusione 
E' inevitabile convenire che né la presenza di sincizi, né il riscontro della p24, né l’attività transcriptasica inversa, né la presenza di particelle similvirali (insomma ciascun elemento che definisce positiva una coltura dell’HIV) sono “evidenza di replicazione virale”, nonostante il significato attribuito sia proprio questo.  

Identificazione diretta degli acidi nucleici 
Per identificazione diretta degli acidi nucleici vengono intese le tecniche del Southern Blot, la PCR, le tecniche di amplificazione quantitative (RT PCR, bDNA, NASBA). L’identificazione si basa sul riconoscimento e l’amplificazione di piccole sequenze nucleotidiche attribuite all’HIV, non dell’intero genoma virale.  
Tale ricerca viene effettuata non su colture, ma direttamente sui tessuti (compreso il sangue) del paziente. 

a) Tecnica del Southern blot (tecnica che permette di separare ed evidenziare acidi nucleici del tipo ricercato) 
Il primo studio fu condotto da Gallo nel 1984. Usando la tecnica di ibridizzazione Southern Blot (capace teoricamente di identificare una sola cellula infetta su 10), furono esaminati i tessuti di pazienti con AIDS, ma deboli bande furono ritrovate solo in una minoranza di essi. 

b) La PCR (Reazione polimerasica a catena) 
La sensibilità della PCR è stimata 92-100% ed è in grado di rilevare una cellula “infetta” su 100.000. 
Tuttavia per la sua alta sensibilità è altamente soggetta alla falsa positività a causa di contaminazioni anche minime o ad altri comuni errori di laboratorio. 
Sequenze simil-retrovirali sono rinvenibili nel genoma umano in ogni cellula. 
Già nel 1991, Imagawa e Detels fecero notare una potenziale fallacia della PCR. “La determinazione di parte del genoma - sostenevano - non significa rivelare un virus completo”. 
Molto importante è il problema dei falsi positivi. Molti ricercatori contestano l’affidabilità della PCR a causa dell’alto numero di falsi positivi che questo test produrrebbe. La PCR non si è dimostrata riproducibile e falsi positivi e falsi negativi furono osservati in tutti e 7 i laboratori di riferimento coinvolti in un importante studio francese (la concordanza con la sierologia variava dal 40% al 100%). In più, il numero di risultati positivi non differiva significativamente tra i sieronegativi ad alto e a basso rischio.  
Vi sono numerose altre conferme a queste osservazioni: 
1) Uno studio di efficacia nel valutare le prestazioni dell’HIV PCR nell’individuare DNA virale libero da cellule dimostrò “un disturbante alto tasso di positività non specifica” usando gli inneschi comunemente utilizzati (SK38/39, per il gene della p24 o gag). In realtà, simili tassi di positività vennero trovati sia per i campioni anticorpo negativi che quelli anticorpo positivi (18% contro il 26%). 
2) La PCR (DNA-PCR qualitativa) effettuata su infanti                 non  infetti risultò in diverse occasioni positiva. 
3) In uno studio di validità della PCR coordinato dal Gruppo di Lavoro sulla PCR dell’OMS, il 54% dei laboratori coinvolti avevano problemi con risultati falsamente positivi; 9,3% dei campioni non infetti erano riportati come positivi. 
4) Gli autori di uno studio multicentrico di valutazione di qualità, affermarono: “questo studio ha dimostrato che i risultati falsi positivi, nonostante l’uso di rigorosi algoritmi procedurali, capitano tra gli individui non infetti con frequenza tale da rimanere un serio problema”.  
Il riscontro di un numero rilevante “falsi positivi” depone per una notevole mancanza di specificità della PCR. 

c) Tecniche quantitative 
Le tecniche “quantitative” sarebbero in grado di calcolare, in modo approssimativo, il numero di virioni per millilitro di plasma utilizzando delle opportune modificazioni di certe tecniche di amplificazione (amplificazione del substrato, come la RT-PCR e la NASBA, o amplificazione del segnale, come la bDNA). Il substrato consiste in “regioni conservate” di un gene presunto virale. 
La sensibilità calcolata è: per la RNA RT-PCR di 100 copie of HIV RNA per millilitro di plasma                     
; per la NASBA di 1.000 molecole per millilitro 
; per la bDNA (branched DNA) di 10.000 molecole per millilitro. 

Fino al 1994 si riteneva che l’HIV fosse presente in piccole quantità nei tessuti dei soggetti asintomatici e con AIDS e che infettasse poche cellule (1 linfocita su 1.000-100.000). Nel 1995 due studi sembrarono dimostrare invece che l’HIV si replicava molto attivamente fin dalle prime fasi dell’infezione. Le nuove tecniche sopra menzionate permettevano apparentemente di rivelare grandi quantità di virus che prima erano sfuggite all’osservazione. 
Tuttavia se negli infetti vi fosse una massiccia infezione, come alcuni dei più conosciuti esperti sostengono, l’ibridizzazione con il Southern blot sarebbe stata più che sufficiente per rilevarla. Non dimentichiamo che un sorprendente risultato sia con la Southern Blot standard sia con la PCR era “la scarsità o l’apparente assenza del DNA virale in una parte considerevole dei pazienti”. 
Un significativo lapsus freudiano di John Maddox conferma i sospetti: secondo Maddox “sia Ho che Wei ed i loro colleghi furono in grado di arrivare alle loro allarmanti conclusioni solamente dopo una decade di ricerche sull’HIV poiché avevano studiato in équipe con dei matematici e poiché essi furono in grado di usare nuove tecniche per rivelare i bassi livelli di virus coinvolto”!  
Le incompatibilità logiche dei risultati sono macroscopiche ed evidenti. 
a) Vi è infatti mancanza di correlazione tra p24 e tecniche di amplificazione genica. (Abbiamo già menzionato il fatto che la p24 è considerata “prova diretta di identificazione dell’HIV”). 
Nessuna correlazione venne trovata tra il livello di p24 e la RT-PCR. 
La determinazione della carica virale era altamente sensibile quando paragonata alla misurazione della p24 (più del 95% dei pazienti aveva un carico virale rilevabile mentre solo il 40 % aveva una p24 rilevabile), ma nei campioni positivi il livello di antigene e del carico virale aveva una significatività solamente borderline. 
b)Nessuna correlazione venne osservata tra il carico virale quanti               ficato con la NASBA o con Amplicor e la concentrazione con l’antigene p24.  
Nessuna correlazione fu osservata tra la dose infettiva, la carica virale determinata con NASBA o con l’Amplicor (RT-PCR). 
c) Vi è mancanza di correlazione anche tra RT-PCR ed altri test. 
In uno studio su soggetti vaccinati, un gruppo di quattro campioni di siero risultarono positivi alla RT PCR durante un periodo di 11 mesi, incluso un risultato di circa 10<+>4 -105 copie /mL, ed un quinto risultato positivo un anno dopo in un soggetto vaccinato, ma “non infetto”. Per questo, gli stessi autori avanzarono “dubbi riguardanti la specificità della misura del HIV RNA quale standard aureo per lo screening e la conferma dell’infezione”.  
d) Vi è infine mancanza di correlazione tra “virus” e “carica virale”. 
1) Secondo Piatiak, l’alto livello di “virus” nel plasma era 999 per mille “non coltivabile”. 
2) Ho et al. hanno dimostrato che 10.000 “virioni” plasmatici contati con la PCR ramificata corrispondono a meno di un virus “infettivo” per ml 64. 
3) In un più recente studio di Ho si può constatareare che ad una carica di 500.000 unità (!) corrispondevano 0 (zero!) “virus coltivati”. Secondo i dati riportati, al paziente 105 prima della cura (con Ritonavir) erano stati riscontrati 643.000 “virioni”/ml, il cui numero è stato calcolato con il branched DNA assay ad esso corrispondevano più di 1.000 TCID- 50/ml (50% tissue colture infectious doses).  Dopo due giorni di terapia e nei giorni seguenti il “virus coltivabile” era 0 (zero). Nel contempo, ai giorni 2, 3 e 4 i “virioni liberi” (ovvero la cosiddetta “carica virale”) restava superiore a 500.000. Fino al giorno 7 i “virioni” erano ancora superiori a 100.000.   
Un virione è definito come una particella virale completa costituita dall’acido nucleico virale, dal capside e dal pericapside (quando presente). La possibile obiezione che un virione difettivo venga “visto” dal branched DNA assay, ma non venga rilevato dai saggi colturali, non risolve il problema della mancata corrispondenza con gli altri test e con l’impossibilità di vedere queste particelle al microscopio direttamente dai tessuti del paziente, senza passaggi colturali.  
Fosse stato così, Gallo non avrebbe avuto bisogno di ricorrere a frodi, non avrebbe avuto bisogno di tre anni di indefesse ricerche per trovare qualcosa che avesse l’aspetto di un virus. Ci sarebbe arrivato immediatamente assieme ad altri ricercatori.  
Mark Craddock, professore della  School of Mathematics and Statistics, The University of Sydney, Australia ha commentato: “Cos’è questa grande viremia di miliardi di particelle di RNA che possono essere visti solamente con una tecnica non documentata (branched-DNA) o la PCR ma non con test funzionale di infettività”? 

<LOR "IL GENOMA VIRALE           
Come già detto, le tecniche di amplificazione genica riguardano piccole frazioni, non l’intero genoma “virale” ed i risultati ottenuti non danno la sicurezza di trovarsi di fronte all’HIV, tanto più che sono francamente discordanti. A questo punto è perciò legittimo domandarsi qual è veramente e com’è fatto l’originale genoma virale. 
Innanzitutto il gruppo di ricercatori di Perth osserva che "se ci fosse un singolo retrovirus dell’AIDS, un unico retrovirus, allora le differenze genomiche inferiori all’1% dovrebbero essere la regola, non l’eccezione.  
Per esempio, il vaccino al poliovirus Sabin del tipo 3 differiva dal suo progenitore neurovirulento in solo 10 posizioni nucleotidiche dopo 53 passaggi in vitro e 21 in vivo nei tessuti di scimmie. Nel 1977, l’influenza virale A H1N1 riapparve nella popolazione umana dopo 27 anni di inattività con sequenze principalmente identiche a quelle del virus del 1950".  
Sebbene si sia usato il modello della quasispecie di Eigen per descrivere il genoma dei virus dell’RNA, differenze di sequenza anche dell’1% in questi genomi vengono considerate rappresentare “estrema variabilità””. “Molte forze selettive possono stabilizzare le popolazioni virali.  
Questi fattori stabilizzanti possono racchiudere la necessità della conservazione della struttura e della funzione delle proteine, una struttura secondaria dell’RNA, siti di glicosilazione e siti di fosforilazione. 
Vediamo ora qual è il quadro offerto dalla ricerca sull’HIV.  
Fu presto scoperto che “se si testassero due sieropositivi a caso e si analizzasse il materiale genetico del ceppo di uno e dell’altro, essi differirebbero, in media, di circa il 13%”. Inoltre, quello che viene considerato il genotipo dell’HIV deriva dalle analisi di sequenza di subgenomi che misurano dal 2% al 30% del totale. Il dato sconcertante è che tali “genomi” variano fino al 40%.  
“Se il 30% del genoma dell’HIV varia fino al 40%, di quanto varia il 100% del genoma dell’HIV?” è la legittima domanda della Eleopulos e coll.  
Non c’è accordo tra gli studiosi sul numero di geni dell’HIV. 
Nel 1988  si diceva che il genoma dell’HIV consisteva in 8 geni, nel 1990 in dieci. Nel 1996 Montagnier ha riferito che l’HIV possiede otto geni e secondo Barré-Sinoussi, l’HIV ha nove geni. 
Nemmeno il numero dei nucleotidi nel “genoma dell’HIV” sembra costante.  

Le quasi specie 

Poiché venivano riscontrate grandi differenze genomiche  - persino nello stesso individuo albergherebbero almeno 10<+>6 -10 8 
  
“varianti genotipiche”  
- per tentare di giustificare tale fenomeno è stato introdotto il concetto di “quasi-specie”. 
Prima degli anni ’90, le sequenze dell’HIV erano classificate come europee/statunitensi con differenze della sequenza del 20-30% tra questi due gruppi.  
Negli anni ’90, i ricercatori dell’HIV hanno cominciato a dividere il genoma HIV nei sottotipi A, B, C, D, E, etc.  
La base di questo sistema di classificazione è: “(a) i sottotipi sono approssimativamente equidistanti uno dall’altro nel gene env;  (b) l’albero filogenetico env è per la gran parte congruente con l’albero filogenetico gag; (c) due o più campioni sono richiesti per definire un sottotipo di sequenza".  
Tuttavia, “Sono sorti dei problemi nel nominare i sottotipi. Un numero piccolo ma non insignificante di sequenze virali sono ibride, ovvero si possono riunire, per esempio un sottotipo di sequenza del gag diventa problematico quando sorgono forme altamente divergenti di un dato sottotipo: tali forme sono talvolta designate come A’, B’, F’, ecc. E’ sempre più necessario avere dei dati che codificano le sequenze sia del gag che dell’env quando si sta rivendicando una nuova forma o sottotipo”.  
Verso la metà del 1996 erano stati descritti “almeno dieci”(A-J) genotipi dell’HIV-I principali (M) prevalenti e quelli a bassa prevalenza (O) e nuovi genotipi vengono ancora segnalati. 
E’ quindi possibile descrivere i “DNA dell’HIV”, anche se hanno una variazione del 10%, per non menzionare il 20 o il 30 o il 40%, come una “popolazione di genomi strettamente imparentati, e riferirsi ad essi come a quasispecie”? 
L’estrema variabilità del genoma dell’HIV induce a chiedersi che senso abbia riferirsi all’HIV come ad una entità dalla precisa fisionomia. La differenza genomica tra uomini di razza diversa si aggira attorno all’1 per 1.000, tra uomo ed orango-tan al 2%, ma per trovare una differenza del 30%, bisogna confrontare nientemeno che uomo e topo, uomo e asino, uomo ed elefante! Possono correttamente ritenersi il topo e l’asino e l’elefante quasi-specie dell’uomo (fig. 5)? 

PARTICLE DETECTION (identificazione di particelle) 
I Retrovirus sono definiti come particelle con rivestimento di circa 100-120nM di diametro con un core che comprende un involucro proteico e un complesso di ribonucleoproteina.  
I Retrovirus sono classificati in tre sottofamiglie: Spumavirinae, Lentivirinae and Oncovirinae. 
I Retrovirus appartenenti all’ultima sottofamiglia sono divisi in particelle di tipo A, B, C e D. 
A quale di questi debba appartenere l’HIV, non è ben chiaro. Secondo Gallo nel 1984 si trattava di una particella di tipo C, ma nel 1985 ammetteva che poteva essere anche del tipo D.  
Montagnier e colleghi riportarono inizialmente che era una particella di tipo C, quindi di tipo D, e quindi un lentivirus, ovvero di un’altra sottofamiglia. Secondo Munn ed altri il virus dell’AIDS presenta caratteristiche del tipo C, del tipo D e dei lentivirus. Fauci ed altri descrissero l’HIV in colture monocitarie/macrofagiche come particelle retrovirali con caratteristiche di tipo A. 
L’HIV pare assumere un’identità così imprecisa, cangiante, da aggiungere ulteriori motivi di perplessità. 

FOTOGRAFIE            
Diversi ricercatori nel campo dell’AIDS hanno presentato foto               grafie del virus HIV, ma quelle che si vedono sono solo particelle similvirali indistinguibili da microvescicole cellulari normali. Queste particelle, in contrasto con i virus, sono molto instabili quando rimosse dal loro contesto, ed è difficile isolarle e fotografarle in uno stato di vero isolamento.  
Viceversa i virus sono stabili perché essi devono lasciare di nuovo le cellule o gli organismi parassitati. L’uso di tecniche di centrifugazione non costituisce un problema per separare i virus dai vari contaminanti ed ottenere così il loro isolamento - quindi fotografarli, quindi evidenziare le loro proteine ed i loro costituenti genetici in modo diretto. 
I virus veri sono così stabili che è facile fotografarli direttamente come particelle tridimensionali nel microscopio elettronico a scansione senza che sia necessario fissarli prima chimicamente. 
All’opposto, le microvescicole sono così instabili che esse possono essere fotografate solo con un microscopio elettronico a trasmis               sione, che richiede che siano fissate chimicamente in sezioni molto sottili. Tutto ciò che è stato mostrato al mondo intero come micrografie dell’HIV sono sezioni ultrasottili che includono particelle indistinguibili da quelle cellulari (vedi figg. 6-8). 
                   
LA PROVA DELL'(IN)ESISTENZA DELL'HIV            
Una importantissima conferma alle argomentate critiche dei ricercatori di Perth è arrivata nel marzo del 1997: due gruppi, uno franco/tedesco e uno del National Cancer Institute statunitense, hanno finalmente pubblicato le fotografie dei gradienti di densità in cui doveva essere presente il virus HIV isolato, puro (fig. 9).  
Questo dato avrebbe dovuto essere disponibile fin dal momento della scoperta del virus (1983-84), ma nessuno prima l’aveva fatto. Ed il motivo più verosimile è che manca totalmente la corrispondenza tra quello che era riscontrato e quello che avrebbe dovuto esserci. 
Nello studio franco/tedesco le fotografie provengono dalla banda 1,16 gm/ml.  
E’ impossibile dire da quale densità provengono le fotografie dello studio americano, ma presumibilmente è anch’essa corrispondente a 1,16 gm/ml (dove si ritrovano i retrovirus). 
La Eleopulos et al. rilevano che “gli autori di entrambe le pubblicazioni ammettono che le particelle che sono presenti nel materiale della banda di gradiente e che sono definiti HIV rappresentano solo una frazione molto piccola  del materiale totale. Gelderblom et al. affermano che il materiale contiene un eccesso di vescicole cellulari con una dimensione di 50-500 nM, come opposte ad una popolazione minore di particelle virali ...  le vescicole cellulari sembrano essere il maggiore contaminante delle preparazioni di HIV arricchite dalla centrifugazione in gradiente di sucrosio”. 
“Riguardo il piccolo numero di particelle considerate HIV non c’è nessuna prova che lo siano veramente.  
Al contrario:  
(a) le particelle non sembrano avere estroflessioni superficiali. In altri lavori pubblicati da diversi ricercatori, incluso Gelderblom e i suoi colleghi viene espressamente notata l’assenza di queste proiezioni; 
(b) le particelle riferite come HIV non sono sferiche ed hanno diametri superiori a 100-120nM. Nella fotografia al microscopio elettronico di Gluschankof e coll., ci sono frecce che puntano a 5 “virioni” senza proiezioni superficiali, le cui dimensioni sono: 121 X 145; 121 X  169; 121 X 145, 121 X 145 e 133 X 145 nM. 
Nello studio di Bess e coll. sono indicate un totale di sei particelle di HIV, anch’esse prive di proiezioni di superficie, le cui dimensioni sono 160 X 240; 200 X 240; 280 X 280; 208 X 250; 167 X 250 and 250 X 292 and nM.” 
“In realtà, essi sostengono che quelle sono particelle dell’HIV, ma senza fornire nessuna prova.  
Nel materiale di quella banda di densità dovrebbero esserci moltissime particelle virali, invece ne sono indicate solo alcune, in mezzo a molte impurità.  
Queste particelle hanno solo una vaga rassomiglianza con quelle che dovrebbero essere delle particelle retrovirali”. 
“Il punto fondamentale è che ogni genuina particella retrovirale dovrebbe contenere la stessa quantità di RNA e proteine, né più né meno. Questo significa che se noi consideriamo i diametri delle particelle indicate nei due studi citati, essi sono da 1,14 a 1,96 volte più grandi del massimo previsto per il normale HIV. Traducendo questo in volumi, e confrontando con una particella con diametro di 120nM, le particelle franco/tedesche hanno un volume 50% maggiore, quelle statunitensi uno 750% maggiore”, ovvero incompatibile con la difinizione di retrovirus! 
Anche se non è ammesso dagli autori, i dati dei due lavori citati contribuiscono a dimostrare che là dove doveva essere presente l’HIV puro, dell’HIV non c’è traccia. 
                   
CONCLUSIONI 

Nessuno dei test esaminati appare sufficientemente sicuro per individuare un’infezione da HIV. Paradossalmente neppure la “determinazione diretta del virus” è in grado di rispondere allo stesso quesito, tanto è vero che vi è una inconciliabile discordanza dei risultati ottenuti con le varie metodiche che ne vengono perciò invalidati.  
In più non risulta dimostrata l’esistenza di un’entità che possa ragionevolmente chiamarsi “il virus HIV”, sia nelle sue componenti proteiche, sia nel genoma, sia come particella fisica. Il vero significato dei test è meglio compreso se viene esaminata la loro origine. 
Per provare l’esistenza di un nuovo virus sia il gruppo di Montagnier nel 1983 che quello di Gallo nel 1984 separarono il sopranatante di colture ritenute infette in gradienti di densità. Considerarono - erroneamente - che il materiale che si separava al livello di 1,16 mg/ml fosse costituito da “pure particelle di HIV”.  
Le proteine presenti in questa banda e che sono reattive con i sieri di pazienti con AIDS (ma non solo con i loro sieri) furono considerate proteine dell’HIV. Ugualmente, una particolare frazione di RNA ritrovata nella medesima banda di separazione fu considerata il genoma del nuovo virus. Da allora, alcune di queste proteine sono usate per ricavare i reattivi per alcuni test o come immunogeni per produrre negli animali di laboratorio gli anticorpi utilizzati per altri test (un procedimento simile venne seguito con certi frammenti di RNA). A questo punto la spiegazione degli esperimenti di Gallo effettuati nel 1984 appare più chiara: utilizzò un miscuglio di proteine (ritenute virali ma in realtà cellulari) per immunizzare i conigli ed ottenere così un siero che ovviamente reagiva con le stesse proteine presenti nelle colture da cui proveniva.  
In altre parole Gallo ha creduto di dimostrare la sua ipotesi (l’esistenza del virus) con altre ipotesi rivelatesi errate (che l’attività transcriptasica inversa, la presenza di particelle similvirali, gli anticorpi in quel modo trovati fossero specifici per il virus).  
Così sono nati i test che ancora oggi vengono utilizzati e perfezionati per porre una diagnosi così impegnativa. 
Una importante prova della correttezza di questa interpretazione dei fatti sta nei risultati che vennero ottenuti su topi e scimmie nel 1991. In questi studi, allo scopo di valutare un potenziale vaccino, alcuni animali di laboratorio vennero iniettati con componenti cellulari da colture non infette con l’HIV: i risultati furono simili a quelli ottenuti con il “vaccino vero e proprio” (cioé con “virus da colture infette”).  
Nessuna differenza significativa venne rilevata, tanto che il commento perfettamente appropriato ed ancora attuale di John Maddox fu: “la ricerca sull’AIDS si è capovolta”.  
In altre parole, per aver ottenuto quei risultati non c’era alcun bisogno di ipotizzare la presenza di un virus HIV. 

Fabio Franchi  
Specialista in Igiene,  
Medicina Preventiva  
e in Malattie Infettive 
Trieste