Angiogenesi terapeutica

Tonino Bombardini

Abstract Curriculum Bibliografia

Angiogenesi e vasculogenesi

L'angiogenesi è la formazione di nuovi vasi capillari da un letto capillare preesistente, col risultato di un incremento della densità capillare.
La vasculogenesi è la differenziazione in angioblasti da cellule mesodermiche con l'organizzazione di un sistema vascolare prima inesistente.
La vasculogenesi si verifica durante lo sviluppo embrionale in siti ben definiti, mentre l'angiogenesi, la formazione di capillari per "gemmazione" da capillari preesistenti, avviene in numerose situazioni, e dello sviluppo embrionale, e nell'individuo in condizioni fisiologiche e patologiche (1). L'angiogenesi terapeutica è l'utilizzo di strategie angiogenetiche per promuovere l'incremento della densità del letto capillare e quindi migliorare la perfusione nei tessuti ischemici. La regolazione dello sviluppo vasale è un fenomeno complesso, e vari autori hanno proposto più meccanismi di controllo dell'angiogenesi (2).
Gli stimoli angiogenetici più comunemente considerati sono:
1) fattori meccanici 2) squilibri energetici dovuti all'ipossia 3) processi infiammatori.
I fattori meccanici principali sono
a) l'aumentata interazione tra i globuli rossi e le cellule endoteliali, come nella policitemia
b) l'aumentata tensione di parete come risultato dell'incremento della pressione capillare
c) l'aumento dello shear stress come conseguenza dell' incremento delle velocità di flusso.
Lo stimolo dovuto a squilibri energetici si identifica in numerose situazioni di prolungato squilibrio tra la capacità di perfusione del sistema vasale e le necessità energetico-metaboliche dei tessuti. L'ipossia è uno dei trigger ed elemento di controllo maggiore.
Infine, Schaper ha stressato la centralità dei processi infiammatori con l'attivazione delle cellule endoteliali e dei fattori di crescita angiogenetici(3). Un'analisi della letteratura dimostra come più di cinquanta fattori putativi possono essere coinvolti nell'angiogenesi.
La lista si estende dai semplici ioni rame, magnesio e selenio a complessi fattori di crescita. I fattori di crescita più considerati sono il basic fibroblast growth factor (bFGF) e il vascular endothelial growth factor (VEGF)(4-7).
Oltre ai meccanismi di controllo citati, l'angiogenesi puù ulteriormente essere indirizzata da condizioni spazio-geometriche: dimensioni e forma delle cellule endoteliali e di altre cellule come le muscolari lisce, i periciti, le piastrine, i macrofagi e le mast cells. Anche la struttura e la composizione della matrice extracellulare puù influenzare il risultato finale.
Peraltro l'angiogenesi terapeutica sta rapidamente entrando nell'arena clinica. Analizzeremo perciò brevemente:
1. Le evidenze di sostegno all'impatto funzionale del circolo collaterale arterioso (CCA)
2. Le evidenze (molecolari, cellulari, sperimentali e cliniche) che suggeriscono un ruolo nell'angiogenesi dei farmaci cardiovascolari
3. Le nuove strategie di approccio all'angiogenesi terapeutica con fattori di crescita vascolari ricombinanti o con il trasferimento genico.

Sviluppo del circolo collaterale:
breve revisione dei meccanismi
e del significato funzionale

Circolo collaterale coronarico.

L'ischemia miocardica cronica in presenza di stenosi coronariche porta allo sviluppo dei circoli collaterali.
Lo sviluppo di nuovi vasi è stato dimostrato nel miocardio e nel muscolo scheletrico, come conseguenza della discrepanza tra supporto e domanda di ossigeno nei tessuti (8-10). I collaterali derivano da canali anastomotici preesistenti, come risultato sia della comparsa di un gradiente di pressione tra i due estremi, sia per l'azione di mediatori chimici; derivano inoltre da microvasi di nuova formazione, che instaurano nuove connessioni tra letti vascolari adiacenti, in presenza di ischemia tissutale (11,12).
I collaterali forniscono una protezione dall'ischemia tramite un progressivo aumento di pressione nel letto vascolare poststenotico, talora anche con riserva di flusso. Sei mesi dopo occlusione della arteria coronarica circonflessa nel cane, il flusso miocardico da sforzo, misurato con la tecnica delle microsfere radioattive, può aumentare fino a tre volte il basale sia nei territori con normale flusso anterogrado, sia nel miocardio fornito da circolo collaterale.
Nell'uomo, i collaterali coronarici hanno la capacità di migliorare le condizioni di ischemia (13,14). Inoltre, nel post-infarto, la vitalità del miocardio nel territorio del vaso occluso è stata positivamente correlata con lo sviluppo preesistente di collaterali(15). I collaterali coronarici possono inoltre limitare la dismissione enzimatica perinfartuale (16) e prevenire l'evoluzione aneurismatica della zona infartuata (17).

Circoli collaterali in periferia.

Il circolo arterioso degli arti inferiori è un sistema complesso ed affascinante associato con una patologia del tutto unica: il decorso delle arteriopatie obliteranti presenta una progressione dallo stadio asintomatico a quello sintomatico tra i più lenti.
Circa il 70% dei pazienti rimarrà stabile o anche meno sintomatico dopo 5 o 10 anni, meno del 30% richiederà un intervento chirurgico, e meno del 10% arriverà all'amputazione.
Nei ratti, dopo legatura dell'iliaca sinistra, sono stati studiati i collaterali con microsfere radioattive nel tessuto muscolare di entrambi gli arti (18).
Il flusso al polpaccio incrementava dal 43% (confrontato col controlaterale sano) al 70% dopo 26 giorni dalla legatura dell'iliaca. In un modello sperimentale nel cane è stata provocata ischemia sperimentale tramite legatura dei vasi prossimali e distali della gamba (19): in un mese la claudicatio migliorava in accordo col miglioramento della perfusione muscolare, con evidenza angiografica di un buon run-off distale a sei mesi dalla chirurgia. In pazienti di età compresa fra i 70 e 76 anni, dopo ostruzione aterosclerotica della femorale, l'ottimizzazione della perfusione tramite collaterali si verificava al massimo dopo 2 anni (20). Perciò, sebbene il significato funzionale dei collaterali sia ancora dibattuto, dati sperimentali conclusivi ed evidenze cliniche consistenti suggeriscono che i collaterali si sviluppino come adattamento ad un'arteriopatia obliterante (16,17); la risposta individuale è comunque variabile, ed esiste la possibilità di stimolare farmacologicamente lo sviluppo dei collaterali.

FARMACI CARDIOVASCOLARI
ED ANGIOGENESI

Ruolo dell'eparina
nel circolo collaterale arterioso

Dati sperimentali e clinici evidenziano un ruolo dell'eparina nello sviluppo dei circoli collaterali arteriosi.

Dati sperimentali.
Un elevato numero di mast cells circonda i capillari in rapido accrescimento, ma le mast cells da sole non sono angiogenetiche. Azizkhan et al hanno dimostrato che le mast cells provocano un incremento della migrazione delle cellule endoteliali come evento iniziale della neo formazione di un capillare, e che questa migrazione endoteliale è accelerata dall'eparina (23).
Nel 1982 Taylor e Folkman dimostrarono che l'eparina facilita l'angiogenesi indotta da estratti di cellule di epatocarcinoma umano impiantate nella membrana corioallantoidea di embrioni di pollo (24). Questi dati suggeriscono perciò un ruolo dell'eparina come regolatore nel processo angiogenetico (25). Ciò probabilmente accade tramite l'interazione dell'eparina con una famiglia di fattori di crescita proteici stimolanti la proliferazione endoteliale.
Il bFGF è uno di questi peptidi.
Tale fattore è riconosciuto mitogeno per le tre principali cellule vascolari (cellule endoteliali, cellule muscolari lisce e i fibroblasti) ed è chemiotattico per le cellule endoteliali in vitro. Il bFGF prodotto nelle cellule endoteliali viene sequestrato nella matrice extracellulare e nella membrana basale vascolare e si lega all'eparina o all'eparan solfato, che possono proteggere il bFGF dalla degradazione e servono da legame per il bFGF in differenti compartimenti cellulari (26-28).
Un altro fattore di crescita legato all'eparina è il VEGF, con un'attività mitogena specifica per le cellule endoteliali e non per le le cellule muscolari lisce vascolari (29,30). I recettori per il VEGF sono stati identificati sulla superficie cellulare delle cellule endoteliali; il legame del VEGF ai recettori endoteliali viene potenzato dall'eparina e dall' eparan solfato, ma non da altri glicosaminoglicani. Il bFGF può promuovere l'angiogenesi per azione diretta sulle cellule endoteliali o indirettamente stimolando un'up-regulation del VEGF nelle cellule muscolari lisce vascolari (31,32). L'eparina provoca un cambiamento di conformazione dei fattori di crescita citati che facilita il loro legame ai recettori cellulari, li protegge dall'inattivazione, ne potenzia l'attività, ne provoca il rilascio dalla matrice extracellulare, rendendoli pertanto disponibili al legame coi siti recettoriali endoteliali.
Si pensa che questi fattori di crescita legati all'eparina rimangano, in condizioni fisiologiche normali, sequestrati nei miociti, nella matrice extracellulare, o sulla membrana cellulare endoteliale. L'ischemia, associata con l'ipossia cellulare, l'acidosi, ed un incremento dell'adenosina endogena, è un trigger per il rilascio di questi growth factors leganti l'eparina (31).
Una volta attivati, agiscono localmente per attivare o mantenere attivo il processo angiogenetico; l'eparina e l'eparan solfato di per sè non sono angiogenetici ma agiscono come modulatori positivi di aumento ed amplificazione dell'angiogenesi scatenata da altri stimoli.
Evidenze cliniche: il circolo coronarico. Fujita et al hanno studiato 16 pazienti, di cui 10 erano trattati con eparina, con ostruzione di almeno uno dei rami coronarici maggiori ed angina da sforzo stabile (Tab II).
Tutti i pazienti hanno seguito un protocollo di esercizio che prevedeva un test di Bruce due volte al dì per dieci giorni (33). Ai casi trattati con eparina venivano infuse 5000 UI del farmaco in vena venti minuti prima di ogni sforzo, mentre i restanti 6 pazienti eseguivano lo sforzo, senza trattamento eparinico: la durata totale di esercizio ed il doppio prodotto aumentavano di circa il 35% nei pazienti trattati; una coronarografia di controllo evidenziava un significativo incremento di vasi collaterali nel territorio miocardico relativo al vaso ostruito nei pazienti trattati con eparina.
In un altro studio dello stesso gruppo, veniva dimostrato come il solo trattamento eparinico, senza esercizio associato (34), non era in grado di migliorare l'ischemia durante sforzo (Tab II).
Quyyumi et al hanno invece studiato 23 pazienti con angina stabile da sforzo divisi in due gruppi trattati con eparina a basso peso molecolare o placebo (35). Durante le prime due settimane i pazienti eseguivano tre volte al giorno sforzi sino al raggiungimento della soglia ischemica. Otto (80%) dei 10 pazienti trattati con eparina e solo 4 (31%) dei 13 trattati con placebo (p<0.02) presentavano un incremento della soglia ischemica da sforzo. Al monitoraggio ECG Holter 24 ore il numero e la durata degli episodi di ischemia diminuivano del 30% e del 35% rispettivamente (p<0.05) nei pazienti trattati con eparina mentre rimanevano immodificati nel gruppo di controllo.
Evidenze cliniche:
circolo arterioso periferico.
Mannarino et al hanno studiato 44 pazienti con claudicatio intermittens, di cui 22 venivano trattati con eparina (15.000 UI di eparina a basso peso molecolare sottocute giornalmente per 6 mesi). Il trattamento eparinico migliorava la capacità di marcia (prolungando il tempo libero da claudicatio del 25%) in confronto al gruppo placebo che presentava parametri immodificati. Andreozzi et al hanno valutato 40 pazienti affetti da arteriopatia obliterante arti inferiori: i pazienti venivano randomizzanti a trattamento eparinico (12.500 UI di eparina sc) vs ticlopidina 250 mg die per os per un periodo di trattamento di tre mesi (37). Entrambi i farmaci miglioravano alla fine del trattmento lo spazio di marcia libero da claudicatio, con un risultato inferiore per la ticlopidina (32%) vs l'eparina (51%). Cina et al hanno studiato 374 pazienti con arteriopatia obliterante arti inferiori, inseriti in un programma di training fisico con contemporaneo trattamento eparinco (12.500 UI die) randomizzato vs placebo per sei mesi (38).
In entrambi i gruppi si osservava un miglioramento dei parametri di claudicatio misurati su tappeto ruotante a velocità costante e dell'indice di Winsor dell'arto più compromesso. Il miglioramento era più evidente nel gruppo trattato con eparina (80% vs 28% del solo esercizio, p<0.01) e l'efficacia era più marcata nei pazienti più compromessi all'inizio del protocollo.
Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che l'eparina faciliti lo sviluppo dei collaterali stimolato inizialmente dall'ischemia da esercizio nell'uomo.
Dal momento che l'eparina di per sè non ha proprietà angiogenetiche, la sua efficacia dovrebbe essere valutata più appropriatamente come una add-on therapy, all'apice di uno stimolo promotore come l'incremento dell'adenosina endogena, ottenuto con un regolare programma di esercizio o con somministrazione di farmaci come il dipiridamolo determinano accumulo di adenosina endogena.

Calcio antagonisti ed angiogenesi: un possibile effetto stimolante con alcuni dati sperimentali ma senza dimostrazioni cliniche

Alcuni dati sperimentali propongono una modulazione positiva dell'angiogenesi da parte dei calcio antagonisti.
Rakusan (1) ha descritto quantitativamente la crescita vascolare nel miocardio con esempi di angiogenesi sostanziale nel periodo immediato dopo la nascita, unitamente ad esempi di angiogenesi più moderata nel cuore adulto di ratto trattato con nifedipina.
Il trattamento con nifedipina portava ad una crescita capillare moderata ma ubiquitaria, come evidenziata da domini capillari più piccoli, maggior lunghezza dei segmenti vascolari, e proporzione immodificata di capillari prossimali e distali nelle sezioni di tessuto (2).
Gli autori suggerivano che il meccanismo angiogenetico della nifedipina era probabilmente correlato al costante aumento del flusso coronarico provocato dal farmaco. Saito (39) in uno studio controllato con gruppo placebo suggeriva che un incremento della sintesi del bFGF e dei suoi recettori poteva essere correlato all'iperplasia gengivale da nifedipina nell'uomo.
I calcio antagonisti sono una classe di farmaci vasta, con effetto concentrazione-dipendente sui canali del calcio voltaggio-dipendenti e recettori-dipendenti, e sul calcio di deposito (40).
Sebbene esistano alcuni reports sul ruolo della trasduzione di segnali calcio dipendenti ed angiogenesi (41), solo nel lavoro di Saito si trova un'evidenza diretta di una correlazione tra terapia con nifedipina ed espressione di RNA messaggeri per il bFGF nell'uomo. Un legame tra il blocco dei canali del calcio ed il rimodellamento del tessuto vascolare è stato puntualizzato recentemente con la dimostrazione dell'induzione dell'interleukina 6 da parte dei calcio antagonisti (42). L'interleukina 6 ha un ruolo essenziale nel controllo della proliferazione cellulare ed induce la produzione di VEGF. Tutte e tre le sottoclassi di calcio antagonisti promuovono l'induzione dell'interleukina 6. Amlodipina, diltiazem e verapamil, a concentrazioni nanomolari, stimolano l'attività di promozione di interleukina 6 del 214%, 282% e 292% rispetto a controlli non trattati.
L'induzione di interleukina 6 da parte dei calcio antagonisti è indipendente dalle concentrazioni intracellulari del calcio, suggerendo che il meccanismo di induzione dei calcio antagonisti sia calcio indipendente.
Ulteriori studi sono necessari per confermare queste osservazioni preliminari sull' azione angiogenetica dei calcio antagonisti.

Nitrati ed angiogenesi: l'ossido nitrico promuove la proliferazione cellulare tramite il bFGF endogeno.

La vascolarizzazione miocardica aumenta in risposta all'ipossia alveolare cronica (come per l'ipossia da altitudine) o all'aumentato metabolismo cardiaco (nell'ipertiroidismo, nell'incremento del pre e dell'afterload, nell'aumentato inotropismo) e in condizioni di ischemia coronarica cronica.
Denominatore comune di tutte queste condizioni è l'incremento sostanziale del flusso coronarico nelle zone che successivamente esibiranno una neovascolarizzazione. Numerose molecole (l'adenosina ed il VEGF, ad esempio) rilasciate dal tessuto ipossico hanno attratto l'attenzione in quanto possibili legami tra l'angiogenesi e la funzione cardiaca (43). Tuttavia la portata coronarica per sè può rappresentare un importante determinante meccanico dell'angiogenesi (44). La somministrazione continua di vasodilatatori coronarici porta ad un'aumentata vascolarizzazione, ed è stato postulato un ruolo effettivo dell'ossido nitrico (NO), vasodilatatore endogeno di derivazione endoteliale. L'esposizione al NO dell'endotelio coronarico venulare postcapillare provoca un incremento della sintesi di DNA. L'espressione del bFGF aumentava nelle cellule endoteliali trattate con nitroprussiato di sodio e col vasodilatatore peptidico P, NO dipendente; è stato dimostrato che l'espressione del bFGF è sotto l'effettivo controllo della via del NO con un meccanismo autocrino/paracrino (45). Nell'endotelio microvascolare l'incremento del NO intracellulare induce la produzione endogena di fattori angiogenetici che attivano l'endotelio capillare ad un'intensa attività proliferativa-degradativa. Questi dati sperimentali indicano come l'incremento del NO nell'endotelio coronarico conducano ad un'aumentata produzione di bFGF: la vasodilatazione è accoppiata all'angiogenesi, rivelando così un meccanismo di feedback controllato dall'endotelio via NO e bFGF.
Al momento mancano dimostrazioni cliniche di questi dati sperimentali.

Somministrazione orale cronica del dipiridamolo come "nuovo" farmaco antianginoso: l'ipotesi della collateralizzazione.

Il dipiridamolo è un bloccante della ricaptazione dell'adenosina endogena che produce elevati livelli di adenosina tissutale. La formulazione orale è stata a lungo utilizzata come "vasodilatatore coronarico", ma una vasodilatazione inappropriata può essere proischemica. Tuttavia, in un contesto ipossico, l'incremento dell'adenosina interstiziale può promuovere l'angiogenesi.
Dati sperimentali suggeriscono che il trattamento cronico con dipiridamolo incrementi il flusso collaterale e diminuisca la disfunzione ventricolare sinistra indotta dall'esercizio in un territorio miocardico dipendente da un vaso coronarico con stenosi critica.
Il razionale dell'azione antischemica del farmaco è fin troppo ovvia: l'ischemia miocardica è la conseguenza della discrepanza tra apporto e richiesta di ossigeno, il dipiridamolo incrementa marcatamente l'apporto di ossigeno senza aumentare significativamente la richiesta, e perciò si ristabilisce un normale equilibrio dell'ossigeno (46). Quantunque alcuni studi iniziali fossero incoraggianti, il dipiridamolo è stato successivamente abbandonato per questa indicazione sulla base dell'inconsistenza di risultati in trials controllati con placebo, avendo dimostrato per lo più la mancanza di un effetto protettivo a breve o medio termine.
Terapia orale con dipiridamolo nell'ischemia miocardica: il fattore tempo.
L'ischemia miocardica cronica provocata da una stenosi coronarica porta allo sviluppo di circoli collaterali. Questo tipo di sviluppo di nuovi vasi è stato dimostrato nel miocardio e nel muscolo scheletrico come risultato della discrepanza tra apporto e domanda di ossigeno.
È stato dimostrato che l'adenosina è coinvolta nell'azione angiogenetica dell'ipossia (47). In accordo con questo concetto, basse concentrazioni di ossigeno (2%) stimolano la proliferazione di cellule endoteliali in cultura (47) stimolando i recettori A1 e A2 per l'adenosina presenti sulla membrana delle cellule endoteliali (48). Studi molto recenti hanno dimostrato come l'adenosina endogena prodotta dall'ischemia induca nel cuore sintesi di RNA messaggeri per il VEGF. Inoltre, il dipiridamolo aumenta la formazione di capillari nel cuore di ratto e di coniglio (49).
In presenza di una stenosi coronarica critica, l'adenosina agisce come regolatore dei fattori di crescita endogeni inizialmente stimolati da ripetuti episodi di ischemia.
L'effetto benefico sull'ischemia dei circoli collaterali dovrebbe richiedere alcune settimane per divenire apprezzabile, e probabilmente alcuni mesi per stabilizzarsi.
Molto recentemente, è stato sperimentalmente osservato che un trattamento a lungo termine con dipiridamolo aumenta il flusso collaterale e migliora la perfusione transmurale e l'ispessimento sistolico in corso di ischemia da sforzo, con un effetto prottetivo sull'ischemia più marcato di quello fornito dal diltiazem (50). Dal punto di vista clinico, una meta analisi del 1998 relativa a tutti gli 11 trials randomizzati con controllo placebo pubblicati relativi all'efficacia del dipiridamolo nella profilassi dell'angina hanno dimostrato l'esistenza di un effetto benefico statisticamente significativo del farmaco (51).
Se si pensa che il circolo collaterale venga attivato, ci si dovrebbe attendere un miglior risultato per i trials con durata di trattamento più lungo. Nei cani, una volta che si sono attivati i collaterali, rimangono attivi per almeno quattro mesi dall'avvenuta ostruzione.
Una volta che l'effetto benefico dei collaterali si è instaurato, settimane o mesi di assenza di terapia non sono sufficienti per perderne l'effetto.
Altri trattamenti non farmacologici, come la contropulsazione esterna, che si pensa che agire col meccanismo della collateralizzazione, sono caratterizzati da un beneficio che si esprime nell'arco di alcune settimane, e che permane a lungo, anche anni, dopo l'interruzione del trattamento.

LA RIVOLUZIONE DELLA TERAPIA GENICA: VEGF, BFGF RICOMBINANTI E LA TRASFEZIONE GENICA PER INDURRE L'ANGIOGENESI NELL'UOMO

Numerosi studi sull'animale e trials clinici sull'uomo sono in corso per stabilire la sicurezza e l'efficacia dei fattori di crescita vascolari nel trattamento della cardiopatia ischemica (52). Quantunque siano stati identificati numerosi fattori di crescita, la maggioranza delle ricerche sono focalizzate sul VEGF e sul bFGF.

Somministrazione nell'uomo
di fattori di crescita ricombinanti

Esperienza iniziale con la somministrazione locale di FGF ricombinante nell'uomo.
Ventiquattro pazienti sono stati reclutati in un trial randomizzato che comparava con placebo il rilascio locale di FGF ricombinante durante by pass aorto coronarico: alte dosi di FGF (100 mcg) venivano somministrate utilizzando microcapsule inserite nella superficie epicardica al tempo dell'intervento. I dati sull'efficacia appaiono promettenti.
Pare esservi un miglioramento della perfusione miocardica, documentato scintigraficamente e con risonanza magnetica. Il rilascio locale di FGF è sicuro, fattibile e ben tollerato, e un trial in fase II è attualmente in corso.
Studio in fase I di somministrazione intracoronarica (IC) e intravenosa (IV) di FGF ricombinante.
Per stabilire la sicurezza e l'efficacia della somministrazione IC ed IV di FGF ricombinante, 66 pazienti con severa coronaropatia senza possibile indicazione a PTCA o a by pass, hanno ricevuto FGF ricombinante IC (n=52) o IV (n=14). I dati sull'efficacia appaiono promettenti. I pazienti incrementavano il tempo di esercizio all'ischemia rispetto al basale. La contrattilità e la perfusione segmentaria miglioravano in un sottogruppo sottoposto a risonanza magnetica
Studio in fase I di somministrazione IC di VEGF ricombinante.
Lo studio, recentemente terminato, ha dimostrato che, mentre il VEGF ricombinante era sicuro e ben tollerato, non esistevano differenze significative sui dati all'esercizio o nello score dell'angina nel gruppo trattato vs il braccio di controllo.
Fattori di crescita: problemi non risolti. Non è chiaro a tutt'oggi quale sia il fattore di crescita migliore. Deve essere ancora stabilito quale sia la via di somministrazione più efficace. I ricercatori devono ancora identificare l'end point ottimale in questi trials sull'angiogenesi.
Deve essere ancora appurato, infine, quale sia l'approccio migliore tra la somministrazione di fattori di crescita ricombinanti e la terapia genica.

Trasfezione genica per indurre
angiogenesi nell'uomo

La trasfezione genica arteriosa del VEGF è stata studiata come metodo alternativo alla somministrazione della proteina ricombinante per indurre l'angiogenesi nell'uomo. La produzione indotta del VEGF con tale metodo è particolarmente attraente poichè il gene del VEGF contiene una sequenza di trascrizione che permette alla proteina di essere secreta naturalmente dalla cellula intatta.
Studi precedenti (53) suggerivano che la trasfezione arteriosa di DNA codificante proteine di secrezione potessero sortire una significativa efficacia biologica nonostante una bassa efficacia di trasfezione.
Trial in fase I di trasfezione genica intracoronarica.
In uno studio doppio cieco randomizzato i pazienti ricevevano plasmidi per il VEGF (n=10) o placebo (n=5) dopo angioplastica coronarica: un catetere infusore perfusore veniva posizionato nel tratto coronarico candidato alla trasfezione genica ed utilizzato per 10 minuti. Questo trial in fase I ha dimostrato che il trasferimento genico periangioplastica è sicuro e ben tollerato.
Nonostante questi dati interessanti i candidati al trasferimento genico coronarico hanno dimostrato limitazioni potenziali: nei pazienti aterosclerotici, anche in assenza di ispessimento della neointima, gli estesi depositi calcifici spesso presenti al confine intima media, possono limitare il trasferimento genico alle cellule muscolari lisce della media arteriosa.
Trials di trasferimento genico intramuscolare.
Un metodo di trasfezione genica meno invasivo di quello arterioso è il trasferimento genico intramuscolare, la cui via è stata anticipata dagli studi pionieristici di Wolf e colleghi. Il muscolo striato ha dimostrato di essere facilmente trasfettabile e di esprimere geni esterni trasferiti sotto la forma di plasmidi nudi di DNA, ovverossia DNA non associato con vettori virali o di altro tipo. Il trasferimento genico intramuscolare di plasmidi nudi di DNA dovrebbe essere potenzialmente vantaggioso in quanto supera i possibili problemi immunologici associati con vettori adenovirali (54).
Poichè il plasmide nudo di DNA iniettato in muscolo rimane in una forma circolare non replicativa, non integrata col DNA della cellula trasfettata, è assai improbabile che il metodo sia complicato da fenomeni di mutagenesi inserzionale. In accordo con queste premesse, sono iniziati protocolli di studio per testare l'ipotesi che l'iniezione intramuscolo di plasmide nudo di DNA codificante l'isoforma 165 del VEGF possa aumentare la collateralizzazione e la perfusione nel contesto di quadri avanzati di ischemia degli arti inferiori.
In un numero iniziale di pazienti con ischemia grave a riposo degli arti inferiori la trasfezione intramuscolo del plasmide del VEGF 165 è stata effettuata con successo dal gruppo di Isner e collaboratori a Boston (55).
Tale studio è stato il primo a dimostrare la fattibilità della trasfezione genica intramuscolo di plasmidi nudi di DNA codificanti il VEGF per l'angiogenesi terapeutica in particolare ed il primo a dimostrare l'attività biologica del DNA nudo dopo trasfezione intramuscolare per la terapia cardiovascolare in generale.
La trasfezione del gene per il VEGF come sola terapia per l'angina resistente al trattamento farmacologico.
Esperimenti recentemente effettuati in un modello animale di ischemia miocardica hanno dimostrato come il trasferimento genico intramiocardico del VEGF sia sicuro e realizzabile con successo tramite una minitoracotomia.
In accordo a queste premesse, è stato intrapreso uno studio clinico in fase I, a dosi progressivamente crescenti, in aperto per determinare la sicurezza e l'attività biologica della trasfezione genica intramiocardica con plasmide nudo di DNA codificante il VEGF (56).
Il trasferimento genico rappresentava la sola terapia, realizzata senza concomitante angioplastica, stenting o by pass, in pazienti con ischemia miocardica sintomatica. Tutti e 16 i pazienti arruolati hanno avuto un miglioramento sensibile della sintomatologia anginosa ed un'evidenza obbiettiva di incremento della perfusione miocardica. All'ultimo follow-up a 90 giorni, 6 di 11 pazienti erano liberi da angina. Tredici pazienti su 14 avevano documentata evidenza alla SPECT miocardica di ridotta ischemia.
L'angiografia coronarica ha dimostrato sviluppo di nuovi collaterali in 12/13 pazienti al 60o giorno di follow-up.
Questa prima esperienza clinica, sebbene incoraggiante, lascia irrisolte numerosi quesiti: l'ottimizzazione del sito anatomico, del numero e delle dosi delle iniezioni intramiocardiche richiede studi ulteriori.
La strategia della terapia genica come unica terapia realizzata per iniezione intramiocadica per via minitoracotomica non permette una randomizzazione vs placebo (controlli non trattati).
Possiamo anticipare che l'inserimento di un gruppo placebo così pure come test clinici di dosi terapeutiche differenti, inclusi trattamenti multipli, verrà affrontato appena saranno disponibili cateteri per la somministrazione genica intramiocardica per via percutanea: al momento questi sistemi sono in fase di studio in numerosi laboratori.

Tonino Bombardini
Servizio Tecnologie Biomediche
Policlinico S.Orsola - Bologna