Piante come bioreattori per la produzione di vaccini eduli
Le piante si sono rivelate nei secoli come organismi estremamente duttili, capaci di adattarsi alle necessità dell’uomo, sia per scopi agricoli che ornamentali. Circa vent’anni fa, con i primi studi sulla tecnica del DNA ricombinante, è anche stata scoperta la possibilità di introdurre e far esprimere in un tessuto vegetale geni non solo derivanti da altre specie vegetali, ma anche di origine batterica o animale.
Questa scoperta ha aperto nuovi orizzonti per l’enorme numero di applicazioni che si potevano proporre. I primi studi naturalmente sono stati rivolti al miglioramento delle piante stesse, per la loro difesa contro organismi patogeni ed infestanti.
A questo scopo sono stati introdotti geni di resistenza di origine batterica, fungina o isolati da altre piante fornite per natura della difesa desiderata. Da qui ad immaginare che fosse possibile far produrre alla pianta altri generi di proteine, non necessariamente a suo vantaggio, il passo è stato breve. In particolare, grande interesse ha suscitato la possibilità di produrre molecole ad uso sanitario, come antigeni per la produzione di vaccini, anticorpi o proteine a funzione farmacologica.

Come produrre dei vaccini di tipo innovativo
Le tre principali categorie di vaccini oggi disponibili sono costituite da:
vaccini attenuati, costituiti da microrganismi patogeni di cui sia stata ridotta la virulenza;
vaccini inattivati, costituiti da microrganismi la cui virulenza sia stata neutralizzata;
vaccini di subunità, costituiti da elementi purificati di microrganismi, il vaccino in questo caso conterrà solo una parte (costituita da una o più proteine) dell’organismo originale, ma sufficiente a scatenare una reazione immunitaria;
vaccini ricombinanti. Quest’ultima categoria si basa sull’identificazione di molecole ad attività antigenica, capaci di indurre una risposta immunitaria, sull’isolamento del gene corrispondente e sulla produzione del vaccino in un sistema di espressione eterologo, fino ad oggi un microrganismo o un tessuto animale.
Il miglior sistema di espressione sarà naturalmente quello in grado di garantire la sicurezza del prodotto finale, un’attività biologica ottimale ed un costo di produzione contenuto. L’espressione di antigeni in cellule di mammifero ha il vantaggio di dare prodotti idonei, ma la procedura è costosa e non esente da pericoli (possibile presenza di agenti patogeni derivanti dall’animale utilizzato). L’utilizzo di microrganismi come sistema di espressione permette una produzione su scala più ampia ma presenta anche limitazioni quando siano necessarie modificazioni secondarie, tipiche delle cellule eucariotiche (ad esempio, glicosilazione) o un particolare ripiegamento (folding) della proteina prodotta.
Recentemente è stato proposto un nuovo sistema di espressione, basato sull’integrazione degli opportuni geni in piante superiori. Questo offrirebbe vantaggi considerevoli per la sicurezza del prodotto, grazie all’assenza di quelle contaminazioni con patogeni animali o tossine che potrebbero essere presenti in vaccini espressi in cellule animali o batteriche. Data la facilità con cui le piante producono un’abbondante biomassa su scala agro-industriale, l’approccio porterebbe ad una notevole diminuzione dei costi. Infine i vaccini fatti in pianta sarebbero indipendenti dalla “catena del freddo” oggi necessaria per la conservazione e per la distribuzione e potrebbero permettere la somministrazione orale, come alternativa alla via dell’iniezione parenterale (Daniell et al., 2001; Sala et al., 2003).
La possibilità di somministrazione di vaccini eduli espressi in pianta ha suscitato grande interesse anche in campo veterinario, in particolare, per agli animali allevati per uso alimentare, in considerazione delle implicazioni sociali ed economiche legate alla loro salute. La possibilità di fornire direttamente a questi animali delle sostanze ad attività farmacologica sotto forma di cibo, semplificherebbe enormemente le pratiche di somministrazione. Quando anche il vaccino debba essere dosato in modo preciso, le piante transgeniche esprimenti l’antigene possono essere facilmente disidratate, il principio attivo dosato e quindi somministrato dopo essere stato mescolato alla razione giornaliera. Questo porterebbe ad una considerevole riduzione nei costi ed eviterebbe lo stress indotto negli animali dalla pratica iniettiva.
Le ricerche su vaccini prodotti in pianta si sono sviluppate negli ultimi 10 anni in molte direzioni. Di seguito riportiamo alcuni esempi dei primi risultati ottenuti con questa tecnologia: espressione dell’antigene per l’epatite B in tabacco e lattuga (Mason et al.,1992; Eheani et al., 1997), dell’antigene per la rabbia nel pomodoro (McGarvey et al., 1995), di un antigene per il colera in tabacco e patata (Arakawa et al., 1997) e di un antigene per il citomegalovirus in tabacco (Tackaberry et al. 1999). Esperimenti condotti su animali da laboratorio hanno dimostrato la capacità di questi vaccini di stimolare il sistema immunitario inducendo la sintesi di anticorpi contro l’epatite B (Thanavakam et al., 1995), il Norwalk virus (Mason et al., 1996) ed enteriti batteriche (Haq et al., 1995). In una prima sperimentazione su volontari umani, il vaccino costituito dalla subunità B dell’enterotossina di E. coli, espressa in tabacco, ha dato risposta immunitaria, sia a livello mucosale che sistemico, in individui trattati per via orale con un opportuno dosaggio di patata transgenica (Tacket et al., 1998). L’ottenimento di un’immunità mucosale è uno dei punti a favore dei vaccini eduli. Molti agenti patogeni penetrano nel corpo attraverso le mucose. Le prime difese sono quindi quelle presenti sulle mucose stesse che rivestono le vie respiratorie, il tratto digestivo e quello uro-genitale. Per migliorare ulteriormente la capacità dei vaccini espressi in pianta di evocare una risposta mucosale, è stata studiata la possibilità di costruire geni chimerici esprimenti forme detossificate della tossina del colera (CT) e dell’enterotossina termolabile di E. coli (LT), legate come adiuvanti a proteine antigeniche (Di Tommaso et al., 1996; Kong et al., 2001). Inoltre, la cellula vegetale è circondata da una parete cellulosica che la protegge dall’azione dei succhi gastrici. Negli animali non ruminanti, i tessuti vegetali vengono trasportati direttamente nel lume intestinale dove vengono lentamente lisi e possono agire come un sistema naturale a lento rilascio.

Metodi di trasformazione vegetale
Le tecniche per la trasformazione di piante sono fondamentalmente due: il metodo basato sull’uso di Agrobacterium ed il metodo biolistico. Il primo si basa sulla proprietà dei patogeni vegetali A. tumefaciens e A. rhizogenes, di integrare il proprio DNA (T-DNA) nel genoma nucleare delle cellule infettate (de la Riva et al., 1988). L’introduzione di geni esogeni nel T-DNA opportunamente modificato delle cellule di Agrobacterium, e la successiva infezione di un tessuto vegetale, portano all’integrazione stabile del gene di interesse nel genoma della pianta e alla produzione di una proteina transgenica (Figura 1).

L’applicabilità della trasformazione mediata da Agrobacterium, dapprima limitata al tabacco e a poche altre specie, bersagli naturale dell’infezione, è ora ampliata alla maggior parte delle specie vegetali di interesse agronomico, comprese graminacee e leguminose (Lee et al., 2001; Chikwamba et al., 2002). Questo apre interessanti prospettive per lo sviluppo di vaccini eduli per uso sia umano che veterinario.
Il secondo approccio si basa sulla tecnica del bombardamento con microproiettili (Taylor e Fauquet, 2002). Sequenze selezionate di DNA vengono fatte precipitare su microparticelle metalliche e sparate a velocità accelerata con un apposito strumento (particle gun) contro il tessuto vegetale. Le microparticelle penetrano la parete e rilasciano il DNA esogeno all’interno della cellula, dove, attraverso meccanismi non ancora completamente chiariti, si integrerà nel genoma nucleare. Nelle cellule vegetali sono presenti degli organelli citoplasmatici, i cloroplasti, contenenti la clorofilla, noti in generale per la loro funzione fotosintetica. In questi organelli che, come i mitocondri, si pensa derivino da antichi predecessori batterici, entrati come simbionti in una cellula più grande, è presente un corredo genico indipendente, ma con caratteristiche appunto da cellula procariote. È possibile, con il metodo biolistico, “sparare” particelle di DNA opportunamente elaborate che, arrivando all’interno del cloroplasto, si integrino nel suo genoma. La trasformazione del cloroplasto rappresenta un’interessante alternativa alla trasformazione nucleare (Maliga, 2002; Daniell et al., 2002). Infatti, secondo alcuni dati pubblicati sulla trasformazione di tabacco per l’espressione della tossina insetticida di Bacillus thuringiensis (BT), l’introduzione di geni esogeni nel genoma di cloroplasto ha portato ad un accumulo di proteine ricombinanti attive pari al 47% delle proteine solubili totali (De cosa et al, 2001) Questo tipo di trasformazione offre il vantaggio di avere più copie del transgene per cellula. Inoltre, diversamente da quanto avviene nel nucleo, la trasformazione del cloroplasto si basa sull’inserzione del gene esogeno per ricombinazione omologa. È possibile quindi indirizzare l’inserimento del transgene in un punto preciso del cromosoma plastidiale. Questo porta ad evitare effetti posizionali, negativi per la crescita della pianta, che spesso si verificano nelle trasformazioni nucleari, in seguito all’inserimento di un gene in un punto casuale del genoma nucleare.

Sino ad ora tuttavia, l’ingegneria genetica del cloroplasto è stata attuata solo in tabacco e parzialmente in patata. Si può auspicare che col tempo questa tecnologia venga estesa ad altre specie di maggiore interesse per la produzione di vaccini eduli, come ad esempio il mais, la lattuga o il trifoglio.
Nei nostri laboratori, presso il Dipartimento di Biologia dell’Università degli Studi di Milano, è attualmente allo studio la possibilità di esprimere in pianta diverse proteine ad attività antigenica, sia per uso umano che veterinario. Nell’ambito di una collaborazione con l’Istituto Pasteur di Parigi, un poliepitopo (molecola costituita da un insieme di frammenti peptidici ad attività immunostimolatoria) con caratteristiche antigeniche contro il melanoma umano è stato espresso in foglie di tabacco ed è al momento in fase di prima sperimentazione per valutarne il livello di immunogenicità.
In uno stadio più iniziale è la ricerca mirata alla produzione di vaccini veterinari. Questa ricerca, svolta in collaborazione con diversi Istituti della Facoltà di Medicina Veterinaria dell’Università di Milano, vuole prima di tutto verificare le potenzialità del nuovo sistema di produzione di vaccini, attraverso un confronto passo per passo tra vaccini “tradizionali” e vaccini espressi in pianta.

Le fasi della ricerca
Per raggiungere questo scopo è stato necessario individuare patologie per cui esistessero già dei vaccini commerciali, basati su una proteina (l’antigene) di provata capacità immunogenica. Della proteina è necessario conoscere la struttura, la sequenza aminoacidica, ma soprattutto la sequenza nucleotidica del gene da cui essa deriva. Questi dati devono essere accuratamente valutati perché, pur essendo il DNA di ogni essere vivente costituito da soli 4 nucleotidi, e pur essendo il codice genetico pressoché universale, ogni organismo ha delle sue “preferenze” e delle caratteristiche specifiche nei sistemi di traduzione e maturazione delle proteine. Ad esempio, alcuni aminoacidi sono codificati da più di una tripletta di DNA, ma ogni organismo utilizza preferenzialmente alcune triplette rispetto ad altre; è necessario quindi che l’organismo ospite presenti tutte le triplette necessarie per la traduzione della proteina. Altri problemi si potrebbero avere con proteine che necessitino di una glicosilazione, in quanto la struttura chimica dei gruppi saccaridici, aggiunti dalle piante in fase di maturazione di una proteina, può essere leggermente diversa da quella degli animali e questo potrebbe causare la formazione di un anticorpo non perfettamente aderente alle richieste. Tutto ciò va saputo a priori per poter modificare opportunamente il gene da introdurre nella pianta ospite, ad esempio con una mutazione sito-specifica.
Attualmente lo studio si sta sviluppando su diverse linee, mirato a trasformare piante per la difesa contro malattie causate da differenti organismi e con organismi bersaglio altrettanto lontani. Come esempi citiamo la filariosi animale, ma anche umana, causata da un verme nematode, una particolare forma di enteropatia bovina, causata dal batterio Escherichia coli ed una malattia degenerativa dell’apparato respiratorio e riproduttore del cavallo, causato da un herpes virus. Per ognuna di queste patologie è già stata individuata ed ampiamente studiata una proteina che, riprodotta con sistemi tradizionali, può essere utilizzata come vaccino.
Nella prima fase della ricerca, abbiamo scelto di utilizzare come sistema vegetale il tabacco, in quanto è il sistema più noto e meglio studiato, per ridurre al minimo le variabili di cui tenere conto. Naturalmente in questo caso, la sperimentazione sugli animali dovrà essere fatta utilizzando degli estratti proteici, privi degli alcaloidi normalmente presenti nel succo cellulare della pianta. In una fase successiva si prevede la trasformazione di una pianta edule, ad esempio il riso.

I geni, se adeguati per l’espressione nell’ospite prescelto, devono essere posti sotto il controllo di un promotore attivo in pianta, cioè riconoscibile dalle polimerasi vegetali. Questo promotore potrà essere costitutivo, cioè essere funzionale in ogni tessuto dell’ospite, o tessuto-specifico, ed in tal caso si avrà espressione della proteina solo in un determinato tessuto della pianta (ad esempio, il tessuto di riserva dei semi). Il promotore per ora utilizzato è CaMV 35S, sequenza di DNA derivata dal virus del mosaico del cavolfiore e capace, in origine, di favorire la riproduzione del virus stesso in qualunque parte della pianta sia avvenuta l’infezione. A valle del gene è bene porre un terminatore di trascrizione, per facilitare il distacco della polimerasi dal filamento di DNA.

Il complesso promotore-gene-terminatore viene quindi inserito in un T-DNA, all’interno di un plasmide vettore, con capacità di replicazione sia in Escherichia coli che in Agrobacterium tumefaciens; questi vettori, detti binari, portano, come tutti i plasmidi utilizzati in ingegneria genetica, dei geni per la resistenza ad un antibiotico o ad un diserbante, per permettere la selezione delle cellule trasformate. Tutte le prime fasi della manipolazione genetica vengono effettuate in ceppi detossificati di Escherichia coli, batterio molto più duttile e di rapida moltiplicazione, e solo all’ultimo viene effettuata la trasformazione di cellule di agrobatterio.
Una volta effettuati gli opportuni controlli su terreno selettivo, per verificare il corretto inserimento del plasmide recante il gene di interesse nell’ultimo batterio ospite, è possibile effettuare l’infezione di porzioni di foglia.
I “dischetti fogliari” infettati, vengono posti, in condizioni di stretta sterilità, ancora su terreno selettivo, in attesa della formazione di un “callo”, proliferazione cellulare causata dall’agrobatterio (Figura 1). A questo punto, grazie alla presenza nel terreno di opportuni fito-ormoni e alla caratteristica totipotenza delle cellule vegetali indifferenziate, dalle cellule nel cui genoma è entrato il T-DNA con la relativa resistenza ed il gene di interesse, si sviluppa il germoglio di una piantina in miniatura (Figura 2, 3 e 4) che, dopo un certo lasso di tempo, emetterà delle radici (Figura 5) e potrà essere trasferita dal terreno agarizzato al normale terriccio (Figura 6).

 

Per due delle linee che sono state portate ad esempio, quella della filariosi e quella dell’herpes virus equino, la ricerca è arrivata a questo punto e al momento sono in corso le analisi per valutare il livello di espressione delle due proteine nelle piantine di tabacco GM.
Come chiunque abbia avuto esperienza di ricerche di laboratorio in campo biologico potrà facilmente dedurre, lo studio qui descritto è tutt’altro che privo di difficoltà, ma noi, come gli altri gruppi che nel mondo stanno portando avanti questo genere di ricerche, siamo fermamente convinti che sia una strada estremamente promettente, sia come alternativa alle soluzioni già esistenti, sia per risolvere alcuni problemi che non hanno ancora trovato una soluzione adeguata.

Prof.ssa Barbara Basso
CNR - Universitá degli Studi di Milano
Dipartimento di Biologia
“Luigi Gorini”- Milano