Introduzione
Fin dall’inizio degli anni Cinquanta, la citometria a flusso è diventata una tecnologia altamente raffinata per l’esplorazione delle superfici delle cellule, in un modo veloce e molto preciso. Per mezzo della citometria a flusso, è ormai possibile raccogliere le informazioni concernenti le molecole della superficie delle cellule e la loro espressione durante la differenziazione cellulare; studiare il ciclo cellulare attraverso la valutazione quantitativa delle modificazioni nel contenuto di DNA; svolgere studi funzionali di una varietà di parametri cellulari e ottenere delle popolazioni arricchite di cellule per ulteriori studi. Può essere detto, giustamente, che, nell’arco di quattro decenni, la citometria a flusso è diventata uno strumento indispensabile nel servizio del biologo di base nonché del patologo e del clinico. Sarebbe impossibile dettagliare in un capitolo breve tutte le applicazioni della citometria a flusso nello studio degli elementi strutturali e delle funzioni del sistema immunitario. Questo capitolo cercherà di riassumere, in maniera abbastanza concisa e maneggevole, lo sviluppo delle tecniche della citometria a flusso e delle maggiori applicazioni della citometria a flusso nello studio dei processi immunitari. Si rimanda il lettore ai numerosi libri su questo argomento, che forniscono una descrizione più dettagliata delle tecniche e delle applicazioni, e anche alla letteratura, vasta e sempre in aumento, che descrive gli utilizzi innovativi della citometria a flusso per l’investigazione dei diversi aspetti del sistema immunitario e dell’infiammazione nella salute e nella malattia.

Background
I tentativi precoci di analizzare le cellule in modo rapido e preciso risalgono agli anni Cinquanta. Infatti, le prime opere della citometria a flusso erano rivolte alla valutazione del potenziale di questa tecnica per determinare il contenuto di DNA nelle cellule e per distinguere fra le cellule normali e quelle maligne. La scoperta che interagivano nelle risposte immunitarie due popolazioni distinte di linfociti, T e B, ha rafforzato l’interesse nello studio di queste due popolazioni, per caratterizzarle e per capire le loro funzioni e le loro interazioni. Innanzitutto, le metodologie erano sviluppate per individuare i linfociti T e quelli B per mezzo della microscopia a fluorescenza con l’anti-Ig (linfociti B) e per mezzo della formazione a rosetta con eritrociti degli ovini (rosette E, rosette T). La capacità di produrre anticorpi monoclonali e la semplificazione della citometria a flusso hanno dato il via ad una rivoluzione, ancora in corso, della nostra capacità di svolgere analisi cellulari, che sono precise, obiettive, rapide, in una varietà di situazioni cliniche e di ricerca.

Anticorpi monoclonali
Proprio la scoperta di una metodologia semplice per la produzione di anticorpi monoclonali ha dato il via ai tentativi di ricerca rivolti alla produzione di reagenti monospecifici da utilizzare per individuare le molecole superficiali delle cellule, espresse nelle diverse fasi di differenziazione, da impiegare in unione con la citometria a flusso. Fin dalla descrizione iniziale, gli anticorpi monoclonali che riconoscono gli antigeni simili delle cellule immunitarie e infiammatorie e dei loro prodotti sono stati introdotti molto rapidamente dagli investigatori e dai fornitori commerciali di reagenti di laboratorio. E, mentre il tempo passava, ogni fornitore dei reagenti monoclonali ha stabilito un titolo per individuare ciascun monoclonale. Questo ha portato a questioni concernenti la specificità di ogni nuovo monoclonale ed alla confusione considerevole nel riportare i dati ottenuti dalla citometria a flusso e dagli altri studi impiegando gli anticorpi monoclonali, in quanto i reagenti dei diversi fornitori hanno portato una designazione differente. C’erano due necessità importanti:
1) certificare la specificità di ciascun anticorpo monoclonale e
2) stabilire un sistema di nomenclatura per lo scambio di informazioni in una lingua condivisa.
Quindi, è stato organizzato un Comitato di esperti che periodicamente valuta i risultati delle prove di specificità per ogni nuovo monoclonale ed assegna a ciascuno, una volta approvato, un codice CD. Oppure, un codice wCD se ancora l’anticorpo è sotto valutazione. Queste designazioni riflettono il gruppo di antigene verso cui un particolare monoclonale avrà specificità. Un esame accurato dell’elenco attuale degli anticorpi monoclonali può rivelare un’indicazione dell’esplosione d’attività in questo campo, a beneficio di una comprensione sempre più profonda delle cellule e delle molecole interessate nelle risposte immunitarie e nell’infiammazione. Evidentemente, dunque, la combinazione degli anticorpi monoclonali facilmente disponibili con gli sviluppi delle tecniche della citometria a flusso ha contributo alla nascita di un nuovo paradigma per l’analisi rapida, precisa e in tanti casi quantitativa, delle cellule.

Principi fondamentali della citometria a flusso
L’emicitometro a flusso consiste di tre componenti principali: un sistema fluidico che controlla la captazione cellulare e il flusso cellulare; un sistema ottico che “interroga” le cellule mentre attraversano un raggio laser; e un sistema elettronico che controlla gli strumenti e raccoglie, raffigura ed analizza i dati. Le cellule vengono introdotte come una sospensione a cellule singole in un flusso di soluzione clorurata isotonica e viaggiano come “un flusso dentro un flusso”, per mettersi in linea e passare attraverso un beccuccio in fila. Mentre procedono, e mentre vengono alla fine espulse oppure ricuperate (vale a dire la separazione per i tipi specifici delle cellule), attraversano un raggio di luce che “interroga” ogni cellula per quanto riguarda le caratteristiche richieste. Le fonti di luce più impiegate sono i laser a gas, preferibilmente quello di argon perché emette, a 488 nm, una linea di luce di eccitazione utile, con i fluorocromi più comuni in uso attualmente. Nel componente elettronico di un emicitometro a flusso, il segnale di luce emesso da una cellula alla sede di interrogazione viene convertito in un impulso elettrico (più comunemente sarà un segnale analogico). I segnali analogici sono poi convertiti nei segnali digitali che vengono raffigurati su uno schermo da un tubo a raggi catodici. L’avvento di computer sempre più potenti ha consentito l’introduzione di sistemi computerizzati per controllare l’operazione degli emicitometri a flusso, nonché per la raccolta, la memorizzazione e l’analisi dei dati. Cellule singole sono richieste per le misurazioni della citometria a flusso e questo rappresenta un fattore limitante che previene gli studi dei tessuti che non possono venire facilmente dispersi in una sospensione di cellule singole. I campioni sono solitamente sospesi in una soluzione clorurata tamponata con il fosfato, 0,2% di albumina di siero bovino e 0,01% di sodio azide (PBS+). A seguito dell’esposizione all’anticorpo monoclonale adatto per 30 minuti nel buio, per evitare la riduzione di radiazioni fluorescenti, i campioni vengono lavati, risospesi nella PBS+ ed esaminati nell’emicitometro a flusso. Può essere utile ricordare alcuni principi fondamentali per la manipolazione dei campioni. Nella pratica clinica, i campioni più comuni sono il sangue periferico, aspirati di midollo osseo, o sospensioni cellulari monodisperse dai linfonodi. Nelle situazioni di ricerca, il campione può essere di qualsiasi tipo di cellula sospesa in uno stato monodisperso. Per il sangue periferico e per il midollo osseo è necessario eliminare gli eritrociti per mezzo di un agente lisante (di solito cloruro di ammonio) che non influenzerà le cellule mononucleate soggette all’esame (Fig. 1).

Una cellula (oggetto più scuro e ovale) portando antigeni superficiali è esposta ad un anticorpo monoclonale e gli eritrociti sono lisati prima che il campione venga introdotto nella camere a flusso

Nella camera a flusso, le cellule fluiscono in fila indiana e quando una delle cellule interseca con il raggio laser (punto d’interrogazione) la luce, colpendo la cellula, viene dispersa in ogni direzione. La luce dispersa in avanti (un’indicazione delle dimensioni della cellula) e quella dispersa verso i lati (un’indicazione della struttura interna della cellula) sono raccolte dai tubi foto-moltiplicatori che amplificano il debole segnale di luce. I segnali di luce sono poi processati come descritto sopra e raffigurati come puntini sullo schermo: ognuno rappresenta un evento come determinato dalle proprietà della dispersione di luce possedute dalla cellula. Una distribuzione sarà quindi ottenuta, dai gruppi di puntini che rappresentano popolazioni distinte di cellule, con diverse dimensioni e varie strutture interne (un citogramma o “bit map”). A questo punto, necessita delineare la popolazione di cellule che sta per essere esaminata ulteriormente, per determinare le caratteristiche soggette allo studio per mezzo dei segnali fluorescenti emessi dagli anticorpi monoclonali legati agli antigeni della superficie della cellula. Questo viene compiuto ponendo una finestra elettronica (“gate”) intorno al gruppo di nostro interesse (Fig. 2).

Schema di un citogramma che mostra tre popolazioni cellulari distinte come delineate per mezzo delle proprietà che spargono la luce. Dimensione = dispersione in avanti e complessità = dispersione ai lati

Mentre vengono introdotte consecutivamente le aliquote di cellule “tinte” con diversi anticorpi monoclonali nel citometro a flusso, le cellule esaminate saranno quelle che stanno nel “gate” stabilito. Saranno poi raffigurati i dati nella forma di un istogramma, come la quantità di eventi verso l’aumento d’intensità relativa di fluorescenza secondo una scala di logaritmo-logaritmo (Fig. 3).

Schema di un istogramma raffigurante l'intensità della fluorescenza verso il numero di cellule contate. La freccia indica il punto nel quale scompare la fluorescenza di fondo come determinato da un controllo isotopico

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Inoltre, è possibile analizzare campioni tinti con combinazioni di anticorpi monoclonali, ognuno contrassegnato con un fluorocromo unico e diverso. La figura 4 mostra un esempio di un campione “doppio-tinto” per rilevare contemporaneamente le cellule che esprimono due antigeni superficiali distinti.

Schema di un istogramma da un'analisi a due colori di linfociti T. Doppio-colorate, le cellule CD3/CD4+ nel quadrante 2 rappresentano linfociti T aiutanti

Analogamente, è possibile studiare cellule contrassegnate con tre o anche più monoclonali grazie alla disponibilità dei computer, che aiutano nella raffigurazione dei dati derivanti da questi quadri molto complessi. Un esempio di un’analisi a quattro colori viene illustrato nella Fig. 5.

Stampa di emocitometro a flusso da un campione di linfociti da un donatore normale. Pannello 1: la distribuzione cellulare secondo la dispersione di luce. Pannello 2 "Gating" (o raggruppamento?) secondo la dispersione ai lati (complessità o struttura cellulare) verso CD45 (pan-antigene leucocito, presente su tutti i leucociti). Pannello 3 e pannello 4: linfociti CD3/CD4+ e linfociti CD3/CD8+

Allo scopo di stabilire il gate linfocitario per mezzo di “side-scatter” (spargere ai lati) verso CD45, i linfociti nel gate sono esaminati per le cellule CD3+/CD4+ e per le cellule CD3+/CD8+. L’utilizzo dei fluorocromi diversi per i quattro monoclonali impiegati consente lo svolgimento di questa determinazione su un campione di una cellula singola. Tale esempio sottolinea il potere della citometria a flusso di compiere l’analisi cellulare in un modo preciso e facile, esaminando pluriparametri su un unico campione, uno strumento molto utile quando ci siano poche cellule disponibili per l’analisi. In definitiva, la capacità di interpretare i dati delle analisi a multicolori risiede nell’abilità di raffigurare gli stessi dati, affinché ogni popolazione di cellule, come rilevato da un unico antigene diverso, venga chiaramente delimitata. E’ altrettanto importante compensare la sporgenza delle varie bande di emissione dai diversi fluorocromi. L’analisi computerizzata dei dati ha massima importanza per lo svolgimento di questi studi di fluorescenza a multicolore.

L’analisi dei dati
Esiste un’ampia varietà di software offerta dai diversi fabbricanti degli emocitometri a flusso per l’elaborazione di dati. Negli ultimi anni ci sono stati tanti progressi nella produzione di software, sempre migliore e sempre più facile da usare, che consente agli operatori di osservare e di modificare la raffigurazione dei dati mentre i campioni vengono processati. I dati acquisiti possono anche essere trasferiti ad un altro computer per continuare l’analisi a distanza dall’emocitometro a flusso. Visto che la gamma di software e quella di computer sono davvero ampie, si rimanda il lettore alle descrizioni più dettagliati delle gamme di hardware e software disponibili (vedi la bibliografia).

Immunofenotipizzazione della leucemia e del linfoma
Nell’arco degli ultimi 20 anni ci sono stati progressi considerevoli nell’uso della citometria a flusso nella fenotipizzazione e nel monitoraggio delle malattie linfoproliferative e mieloproliferative. Ha contribuito a questi progressi la produzione di sempre maggiori quantità di anticorpi monoclonali, rivolti verso gli antigeni superficiali delle cellule espresse nel corso della differenziazione cellulare. Inoltre, questo ha consentito il proseguimento della delucidazione approfondita dei passaggi differenziativi delle cellule linfoidi e di quelle mieloidi, contribuendo quindi ad una comprensione migliore dei meccanismi sottostanti dei fenomeni immunitari e infiammatori. I campioni presentati per l’analisi sono i linfonodi, gli aspirati di midollo osseo o il sangue periferico. E’ importantissimo accertarsi che sia completa la coagulazione e che i campioni non contengano microcoaguli, poiché questi ingorgherebbero la camera a flusso e bloccherebbero il flusso delle cellule. Per l’analisi, aliquote che contengono almeno un milione di cellule vengono esposte agli anticorpi monoclonali in un pannello determinato per essere ottimale nell’immunofenotipizzazione di cellule in ciascuna delle varie malattie linfoproliferative e mieloproliferative. Per risparmiare tempo, cellule e materiali, e per ottenere una tipizzazione più precisa delle cellule e rilevare più antigeni superficiali simultaneamente, è ormai procedura comune svolgere la pluricolorazione per le analisi a 2, 3 o 4 colori. I pannelli impiegati nel nostro laboratorio sono elencati nella Tabella 1. I campioni sono esposti ai monoclonali per 30 minuti al buio a quattro gradi, poi una soluzione lisante viene aggiunta ad ogni tubo per lisare gli eritrociti, e i campioni vengono centrifugati, risospesi in soluzione clorurata e lavati, e di nuovo risospesi in soluzione clorurata per la lettura. Nell’interpretazione dei dati, è importante determinare la presenza o meno di cellule anormali, indicazione di una trasformazione maligna. Nel caso delle neoplasie da cellule B, basta la determinazione di monoclonalità per la maggioranza delle cellule per stabilire la presenza di un clone maligno. Alternativamente, se le cellule non esprimono catene leggere, né kappa né lambda, una popolazione di cellule in cui sono espressi gli antigeni CD19 e CD20 delle cellule B può essere interpretata come un’indicazione di un clone maligno di cellula B. Nel caso di linfociti T, la determinazione di una trasformazione clonica è quasi impossibile. E’ importante stabilire la presenza di un fenotipo anormale compatibile con un linfocito T in fase di differenziazione più precoce dei linfociti periferici e maturi. Nelle malattie mieloproliferative, la scoperta di cellule che sono meno differenziate fenotipicamente, che non sono normalmente presenti nel compartimento periferico, indicherebbe una trasformazione maligna. E’ disponibile ormai un gran numero di anticorpi monoclonali per la immunofenotipizzazione precisa di cellule e per la determinazione della fase di differenziazione cellulare. E’ possibile, dunque, attraverso la costruzione di pannelli adatti di anticorpi monoclonali, esaminare campioni di cellule con una grande precisione e determinare i loro immunofenotipi. Inoltre, la rilevazione che le cellule maligne potrebbero portare certe combinazioni di antigeni, di solito presenti nelle cellule del compartimento centrale, e non nel compartimento periferico, è un aiuto ulteriore per stabilire un immunofenotipo anormale. Da sottolineare che i risultati dell’immunofenotipizzazione per mezzo della citometria a flusso devono essere correlati con l’esame morfologico e quello istochimico del sangue, dei linfonodi e degli aspirati e delle biopsie di midollo osseo. Anche l’analisi citogenetica, in addizione a quelle sopraddette, è un aiuto inestimabile per chiarificare una diagnosi e per proporre la cura.

Il monitoraggio dell’infezione HIV
La dimostrazione di un calo progressivo del numero di linfociti CD4+ nell’infezione HIV ha aperto un nuovo capitolo nell’uso della citometria a flusso per il monitoraggio delle malattie. Nell’ultimo decennio, c’è stato un aumento nell’attività di raffinare le metodologie per la numerazione esatta dei linfociti CD4+ nel sangue di individui infetti con HIV. Questo movimento verso una precisione sempre migliore è stato spinto in parte dalle considerazioni economiche, in quanto la rilevazione di 200 linfociti CD4+/ul era uno dei criteri (e forse quello più importante) per determinare l’eleggibilità ad avere un’assistenza finanziaria. Evidentemente la citometria a flusso, come tutte le altre tecnologie, è soggetta ad una variabilità, sia a livello degli operatori sia degli strumenti, e quindi procede il monitoraggio e il raffinamento della metodologia per l’enumerazione di linfociti CD4+. Nella figura 6, è presentato il metodo migliore di accettazione attuale, per enumerare cellule CD4+ per mezzo della fluorescenza a due colori, benché siano impiegate, quando fattibile, le fluorescenze a tre o quattro colori.

Procedura di colorazione per i campioni dai pazienti HIV+, secondo le migliori tecniche di controllo della qualità attualmente accettate

E’ importante ottenere il sangue in etilendiaminatetracetato come anticoagulante, per immagazzinare i campioni a temperatura ambiente finché siano sottoposti al procedimento; sottoporli a un procedimento entro 24 ore e assicurare che non ci siano microcoaguli nei campioni. Una fluorescenza di fondo deve essere stabilita con controlli isotipici, per assicurare che non ci sia nessun legame aspecifico di un’immunoglobulina particolare ed aspecifica dello stesso isotipo come quello dell’anticorpo monoclonale utilizzato. La doppia-colorazione CD14/CD45, consente il “gating” di tutte le cellule CD14/CD45+ (cioè, i leucociti che non siano monociti). I passi susseguenti enumerano le cellule CD4+ e CD8+, sul numero totale di CD3+ (cellule T). Il controllo di qualità rigoroso e intra-laboratorio degli strumenti, dei reagenti e dei processi è di massima importanza in tutte le fasi di questa procedura, nonché il monitoraggio frequente dei risultati per assicurare una riproducibilità attraverso le aree geografiche diverse. Una questione ancora molto discussa riguarda la traduzione dei dati dalla citometria a flusso, ottenuti come percentuale di una popolazione cellulare, in dati assoluti, cioè cellule/ul. Nel tentativo di evitare la necessità del calcolo dei numeri assoluti per mezzo dell’utilizzo dei risultati dei conteggi delle cellule ematiche ottenuti con gli analizzatori del sangue e la percentuale di cellule CD4+ ottenuta attraverso la citometria a flusso, sono stati introdotti strumenti che riporteranno risultati nella forma di numeri assoluti. Non è compito di questo capitolo discutere i pregi o difetti relativi a tali strumenti. Si consiglia al lettore di leggere la letteratura abbondante concernente questi strumenti e le loro caratteristiche, nonché le numerose questioni sotto discussione relative alla determinazione assoluta delle cellule CD4+.

Altre metodologie
Continua l’interesse nello sviluppo di nuove applicazioni per gli scopi clinici e di ricerca.

Conteggio dei reticolociti
La citometria a flusso è sembrata subito molto utile per un’enumerazione più obiettiva e precisa dei reticolociti. Un metodo facile a tale fine è ormai disponibile ed il suo utilizzo sta crescendo rapidamente, poiché presta una metodologia obiettiva che non comporta un’osservazione visuale con un microscopio e richiede una fatica molto ridotta. Questa tecnologia impiega colori di fluorescenza che si legano al RNA residuo, identificando in questo modo i reticolociti. I coloranti che si sono confermati utili associano la specificità di legame RNA a una buona emissione di segnali di luce, e questo consente la discriminazione del colorante legato alle cellule da quello di fondo. L’auromina O e il tiazolo-arancio sono attualmente i coloranti preferiti nell’analisi dei reticolociti.

Anticorpi antipiastrinici
Nelle trombocitopenie, può essere utile l’abilità di rilevare gli anticorpi antipiastrinici. Gli anticorpi possono essere contro gli antigeni piastrinici o contro l’immunoglobulina legata alle piastrine e la loro rilevazione è utile nelle trombocitopenie di diverse cause. La citometria a flusso fornisce un metodo molto obiettivo e preciso per far rilevare questi anticorpi, ed è preferibile agli altri metodi finora disponibili. E’ evidente un maggior vantaggio quando esiste un conteggio basso delle piastrine, in quanto la citometria a flusso può essere svolta utilizzando piccoli campioni.

Il monitoraggio immunologico nel trapianto
L’anticorpo monoclonale OKT3 che si rivolge contro il pan-antigene CD3 delle cellule T è diventato una parte importante dei regimi di terapia immunosoppressiva nella cura dei pazienti con trapianti di organi. Il suo utilizzo è basato sull’antagonismo verso i linfociti T, le cellule coinvolte in prima linea nel rigetto, per mezzo di un meccanismo non ancora completamente chiarito, evitando così episodi di rigetto. OKT3 deve venire somministrato in dosi che mantengano la quantità delle cellule T a un livello non-rilevabile. La determinazione per mezzo della citometria a flusso delle cellule T/ul è diventata normale nel monitoraggio dei pazienti che ricevono OKT3 a seguito di un trapianto di organo. E’ di massima importanza in queste determinazioni ottenere risultati di alta precisione e riproducibilità nelle determinazioni sequenziali. Un’altra modalità presentata ultimamente è la valutazione dell’effetto delle ciclosporine sulle cellule a bersaglio per guidare il dosaggio terapeutico. La misurazione dell’IL2 intracellulare in linfociti del sangue periferico stimolati con “PMA-ionomycin” può rilevare una soppressione della risposta alla stimolazione, espressa nelle quantità di IL2 intracellulare, nei linfociti dei pazienti trattati con tassi crescenti di Ciclosporina A nel sangue. Questa metodologia può aiutare a discriminare fra dosi tossiche e terapeutiche e anche nello sviluppo di una dose ottimale.

Resistenza ai polifarmaci terapeutici
È diventato evidente che la resistenza ai farmaci è una causa del fallimento terapeutico nella chemioterapia del cancro, e che una varietà di meccanismi può essere responsabile di questo fenomeno. Un meccanismo che è stato chiarito coinvolge l’efflusso dei farmaci terapeutici dalle cellule, mediato da una glicoproteina-P (Pgp). Una varietà di anticorpi monoclonali contro Pgp è disponibile per condurre studi sull’attività Pgp nella resistenza ai farmaci, una metodologia utile nella valutazione delle terapie con più farmaci.

Le misurazioni intracellulari
La rilevazione delle molecole delle membrane cellulari, esposte sulla superficie cellulare, è facile da compiere, in quanto sono subito disponibili queste molecole per gli anticorpi monoclonali. Un problema più complesso era quello di legare gli anticorpi monoclonali agli antigeni localizzati all’interno della cellula: si richiedeva che l’anticorpo monoclonale fosse introdotto nella cellula conservando contemporaneamente l’integrità della membrana cellulare affinché il tipo cellulare fosse determinabile per mezzo dell’identificazione degli antigeni superficiali. La soluzione per questo problema è arrivata con la dimostrazione che gli anticorpi monoclonali potrebbero essere introdotti nella cellula modificando l’integrità della membrana con una fissione di luce che non distrugga in modo significativo gli antigeni superficiali. Lo sviluppo di questa tecnica ha consentito lo studio delle molecole intracellulari, come le citochine, nelle varie cellule, contribuendo così alla nostra comprensione delle funzioni cellulari per mezzo della misurazione sequenziale di molecole che vengono espresse mentre la cellula o si differenzia o si metabolizza. Altre misurazioni intracellulari hanno coinvolto lo studio sul trasporto di calcio per mezzo dell’impiego di coloranti che vengono co-trasportati con il calcio. Un esempio dell’utilità di questa tecnica è la possibilità di misurare il flusso intracellulare del calcio, un evento precoce nell’attivazione cellulare.

La tecnologia “a grani”
Un problema particolarmente scottante era presentato dalla possibilità di analizzare i prodotti cellulari in soluzione, piuttosto che dentro le cellule. Nei ultimi anni, come risposta a questo problema, è stata proposta una tecnica che prevede l’utilizzo di grani o perline di plastica rivestiti con un anticorpo monoclonale mirato al prodotto da rilevare. I grani sono poi trattati con lo stesso anticorpo monoclonale marcato con un fluorocromo ed esaminati in un emicitometro a flusso. La fluorescenza presente sui grani indica la captazione del prodotto da rilevare da parte del grano, e la captazione susseguente del monoclonale fluorescente da parte del prodotto legato al grano. E’ ormai possibile, mediante grafiche di calibrazione, rilevare, in modo quantitativo, i prodotti cellulari in fluidi a livello pg. E’ interessante notare che la combinazione della rilevazione a grano di un prodotto extracellulare solubile, alla rilevazione dello stesso prodotto all’interno della cellula, può fornire dati preziosi sull’accumulo e sull’espressione del prodotto e la sua secrezione, in tal modo consentendo gli studi cinetici sulle cellule attivate.

L’analisi del DNA
Anche se non è direttamente pertinente all’argomento di questo capitolo, l’analisi del contenuto di DNA per determinare il ciclo cellulare e la ploidia cellulare necessita un breve accenno. Gli utilizzi più precoci della citometria a flusso erano mirati all’analisi del DNA con l’impiego di coloranti che si legassero al DNA e alla misurazione dell’intensità di fluorescenza emessa da un colorante specifico. Una cellula nello stato di riposo conterrebbe una quantità normale di DNA, mentre una cellula alla fine del doppiamento di DNA, e in ogni parte della mitosi, conterrebbe due volte la quantità di DNA. Nel corso della sintesi del DNA, ci sarebbe una quantità diversa di DNA in ogni cellula. L’uso di coloranti che si leghino al DNA in modo stechiometrico consente la rilevazione quantitativa del contenuto di DNA. Il raffinamento dell’analisi del DNA ha reso invitante l’impiego della rilevazione DNA per valutare la ploidia e la sintesi di DNA nelle cellule maligne, per correlare questi dati con il grado di malignità e con la prognosi. La letteratura in questo campo è cresciuta in modo esponenziale, essendosi verificato uno sforzo sempre maggiore per convalidare l’uso dell’analisi del DNA come un supplemento importante nella diagnosi e nella cura delle malattie neoplastiche. C’è ancora polemica riguardo al ruolo svolto dall’analisi del DNA nella fornitura delle informazioni necessarie, al di là di quelle acquisite da altri metodi convenzionali e stabiliti. Mentre più studi longitudinali continuano ad aggiungere informazioni a quelle già esistenti, diventerà evidente come e quando l’analisi del DNA possa essere uno strumento diagnostico complementare valido.

Conclusioni
In questo articolo ho cercato di presentare, in modo semplice, un riassunto di alcuni degli aspetti fondamentali della citometria a flusso, in particolare per quanto riguarda il suo utilizzo nell’immunologia. È mia speranza che questo breve riassunto stimolerà i lettori ad approfondire quegli aspetti della citometria a flusso che potrebbero aiutarli nel loro lavoro, sia clinico che investigativo. E vorrei anche incoraggiare quelli che sono interessati, ma che non trovano qui le descrizioni che siano applicabili alle loro esigenze, a cercare nuovi modi di utilizzare la citometria a flusso. E’ una tecnologia ancora giovane e tante applicazioni non sono ancora state sviluppate. Dunque, per finire: buon lavoro e buona caccia!

Mariano Francis La Via
Department of Pathology and Laboratory Medicine
University of South Carolina - Charleston SC - USA